雷公藤紅素對高脂誘導的糖脂紊亂小鼠模型的改善作用及機制研究.pdf

1、代謝綜合癥是嚴重危害公眾健康的問題之一，而糖脂代謝紊亂是代謝綜合癥的重要組成部分。隱熱蛋白（NOD like receptor protein3，NLRP3）炎性通路在代謝綜合癥病理的進程起到至關重要的作用。雷公藤紅素（Celastrol，CEL），是從中藥雷公藤根中提取的三萜類化合物，具有抗氧化、抗癌癥新生血管生成、抗類風濕等作用。研究表明CEL也具有顯著改善高脂誘導的肥胖和胰島素抵抗的作用，但CEL能否通過NLRP3炎癥通路發(fā)揮對高

2、脂誘導的糖脂紊亂的改善作用目前尚未見報道。因此，本實驗旨在采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）和基于核磁共振光譜的代謝組學（1H-NMR）的分析方法，探討 CEL對高脂誘導的糖脂紊亂小鼠模型中 NLRP3炎癥通路和小鼠體內(nèi)代謝物水平的影響，最終為CEL藥理作用機制研究及進一步的臨床應用提供理論依據(jù)。
　　研究目的
　　1.探討CEL對高脂誘導的糖脂紊亂小鼠的作用及作用機制。
　　2.通過1H-NMR代謝組學的方

3、法揭示CEL對高脂誘導的糖脂紊亂小鼠體內(nèi)代謝物質(zhì)的影響。
　　材料和方法
　　1.動物給藥及樣本的收集
　　本實驗采用高脂誘導的糖脂紊亂模型：先將小鼠分別給予高脂飼料和正常飼料喂養(yǎng)10周，隨后隨機將32只C57BL/6J小鼠隨機分成對照組（LFD）、對照給藥組（LFD+CEL）組、模型組（HFD）、模型給藥組（HFD+CEL）。HFD+CEL和LFD+CEL組小鼠腹腔注射給予CEL（100?g/kg，qd）；LFD和H

4、FD組小鼠給予等量的溶媒。連續(xù)給藥6周，隨后進行糖耐量試驗（GTT）和胰島素耐量試驗（ITT）。頸總動脈取血隨后將小鼠處死，取所需組織，并分別采用多聚甲醛固定及-80℃冷凍處理，血樣離心得血漿隨后放-20°備用。
　　2.生化指標的測定
　　嚴格按照試劑盒和儀器操作說明書測定血漿中甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、空腹血糖（FBS）、胰島素（INS）等指標的水平。

5、r>　　3.糖耐量試驗和胰島素耐量試驗
　　實驗當天各組小鼠禁食不禁水6h后，腹腔注射2g/kg葡萄糖溶液或1U/kg胰島素稀釋液，分別于0、15、30、60、120 min從尾靜脈取血，采用羅氏Accu-Check血糖儀測定各點血糖水平。
　　4. Western blot檢測NLRP3介導的炎癥通路的主要蛋白的測定
　　按照制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育的步驟，檢測各組小鼠肝臟中NLRP3介導的炎癥通路中主

6、要蛋白的表達水平。
　　5.1H-NMR血漿樣本的處理及檢測方法
　　將200?l解凍血漿、200?l D2O和100?l蒸餾水混合后離心取450?l上清于5-mm核磁管中備用。使用AVANCE III NMR波譜儀和 Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脈沖序列，得到1H-NMR譜。
　　6.1H-NMR圖譜和數(shù)據(jù)的預處理
　　使用Topspin3.0將所得到的數(shù)據(jù)進行傅里葉轉(zhuǎn)換、手動

7、基線校正和相位處理。采用AMIX軟件處理圖像：以3.03ppm的肌酸酐作為標準校正化學位移，以0.04ppm為最小積分單元將0.5-9.5ppm圖譜分成225個積分段，去除水峰（4.84-5.8ppm）。隨后進行歸一化處理，并將ASCII格式的數(shù)據(jù)導出到Microsoft Excel中進行帕萊托規(guī)格化（Pareto-scaling，Par）計算。
　　7.潛在生物標志物的鑒定
　　根據(jù)變量重要性投影（Variable imp

8、ortance in the projection，VIP）及P<0.05篩選出潛在的生物標志物并與標準化合物（www.hmdb.ca;www.bml-nmr.org）對比，經(jīng)Chenomx NMR軟件套件（Vers.7.6，Chenomx， Edomonton，Cana，da）鑒定。生物化學反應則通過京都基因、基因組百科全書（KEGG）和人類代謝物數(shù)據(jù)庫（HMDB）發(fā)現(xiàn)和鑒定。
　　8.數(shù)據(jù)統(tǒng)計
　　應用SPSS21.0軟

9、件進行統(tǒng)計學分析，計量資料均以?X±S表示，兩組間采用兩獨立樣本的t檢驗，多組間比較采用one-way ANOVA并進行LSD檢驗， P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　研究結(jié)果
　　1. CEL對高脂誘導的糖脂紊亂小鼠模型的作用
　　與LFD組小鼠相比，HFD組小鼠體重升高了38％；腹股溝脂肪的重量及與體重的比值、附睪脂肪重量及與體重的比值、腎周脂肪組織重量及與體重比值分別升高了54%和266%、61%和95%、

10、74%和216%；肝臟、心、腎組織重量與體重的比值降低了14%、38%、13%。同時，HFD組小鼠HMOE-IR、FBS、INS、TC、TG、LDL-C水平分別升高47%、46%、1216%、26%、48%和68%， HDL-C水平降低20%（P<0.01或P<0.05）；胰島素耐量和糖耐量試驗結(jié)果均顯示 HFD組小鼠出現(xiàn)了明顯的胰島素抵抗。HFD組小鼠肝臟中 TG含量增加了99.5%，病理結(jié)果表明 HFD組小鼠肝臟出現(xiàn)了明顯的脂肪樣變

11、和炎性浸潤；脂肪細胞體積變大，邊界模糊。
　　與HFD組相比，HFD+CEL組小鼠體重降低了23%；腹股溝脂肪重量及與體重的比值、附睪脂肪重量及與體重的比值、腎周脂肪組織重量及與體重比值分別降低了67%和59%、62%和51%、59%和47%；肝臟、心、腎組織與體重的比值分別升高了17%、16%和25%。同時，HFD+CEL組小鼠HOME-IR、FBS、INS、TC、TG、LDL-C水平分別降低了65%、28%、46%、15%、2

12、0%和29%， HDL-C水平分別升高19%（P<0.01或P<0.05）；胰島素耐量和糖耐量試驗結(jié)果均顯示HFD+CEL組小鼠胰島素抵抗得到了顯著的改善（P<0.01或P<0.05）。此外，HFD+CEL組小鼠肝臟中TG含量降低了43.7%；肝臟中無明顯的脂肪樣變和炎性浸潤；脂肪細胞體積減小，邊界清淅；LFD與LFD+CEL組小鼠上述指標均無顯著性差異（P>0.05）。
　　2. CEL對高脂誘導的糖脂紊亂小鼠NLRP3炎癥通路

13、的影響
　　實驗結(jié)果表明，與LFD相比，HFD組NLRP3蛋白、Caspase-1 P20蛋白， IL-1?蛋白的表達量分別升高了約230%、133%、310%（P<0.01）。與HFD相比， HFD+CEL小鼠的NLRP3蛋白，Caspase-1p20蛋白，Il-1?蛋白表達量分別下降了約57%、73%和78%（P<0.01或P<0.05）。LFD和LFD+CEL兩組中上述三種蛋白的表達量無差異。同時四組的pro-Caspase

14、-1蛋白表達量無差異。
　　3. CEL對高脂誘導的糖脂紊亂小鼠代謝物的影響
　　通過PCA和OPLS-DA分析得出四組小鼠共有20種主要差異代謝產(chǎn)物。與LFD組相比，HFD組小鼠血漿中LDL/VLDL、葡萄糖、3-羥基丁酸鹽和乙酰乙酸鹽分別升高了約20%、45%、10%和10%，而丙酮酸、檸檬酸鹽、乳酸酯、肌酸水平分別降低了約20%、20%、20%和15%，同時乳酸鹽、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、精氨酸的水平都有不同

15、程度的降低。與 HFD組相比， LFD+CEL組小鼠血漿中LDL/VLDL、葡萄糖、3-羥基丁酸鹽和乙酰乙酸鹽分別降低了約40%、27%、20%和20%，乳酸鹽、丙氨酸和乳酸水平分別增加了約30%、30%和35%，同時增加的還有纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、精氨酸，肌酸等，但對檸檬酸鹽和丙酮酸無影響。CEL對正常小鼠的代謝也有一定的影響。根據(jù)生物標志物的分析鑒定可以推斷出CEL的調(diào)節(jié)作用可能涉及到以下代謝途徑：脂質(zhì)代謝、糖異生和糖酵解、三羧