Junctophilin2對小鼠心肌細胞鈣瞬變的影響.pdf

1、背景介紹：
　　膜耦聯復合物（junctional membrane complexes，JMCs）是與心肌細胞興奮收縮耦聯相關的耦聯細胞表面膜與肌質網膜的細胞結構物質。在心肌細胞中， JMCs是由心肌細胞肌漿膜向內凹陷形成T管，以及肌質網膜形成的“二聯體”結構。功能上，JMCs是細胞膜表面膜與細胞肌漿網（sarcoplasmic reticulum/endo reticulum，SR/ER）離子通道之間實現有效交通的結構基礎。J

2、unctophilin（JP， JPH）是參與形成JMCs的蛋白分子，在哺乳類動物的可興奮細胞，JPH的基因JPH1、JPH2、JPH3和JPH4分別編碼其4個蛋白亞型: JPH1～JPH4[1]。由JPH2基因編碼的蛋白亞型Junctophilin2可促進心肌“二聯體”的形成和穩(wěn)定，也是心肌細胞Ca2+信號系統穩(wěn)定傳導的關鍵分子[2]。RyR2（ryanodine receptor type2）是心肌細胞肌質網膜上ryanodine受

3、體（ryanodine receptors，RyRs）的通道亞型。心肌肌質網因為含有大量Ca2+，有心肌細胞內“鈣庫”之稱。RyR2作為心肌肌質網主要的Ca2+釋放通道存在[3]。胞漿中Ca2+的產生途徑主要是細胞膜上的電壓門控Ca2+通道（voltage-gated Ca2+channels,VGCC）介導的細胞外Ca2+內流和肌質網 RyRs介導的肌質網內 Ca2+的釋放[4]。心肌細胞產生動作電位（ action potentia

4、l，AP）使VGCC開放，引起細胞外少量Ca2+內流。內流的Ca2+作為細胞內的信號激活肌質網RyR2通道，從而導致肌質網內貯存的Ca2+大量釋放進入胞漿，此過程成為鈣離子誘導的鈣釋放(Ca2+-induced Ca2+release, CICR)。
　　Ca2+是維持和調節(jié)心臟生理功能以及體內多種生理過程的重要信號分子。
　　JPH2的敲減引起鈣相關的興奮收縮耦聯的破壞，從而導致心肌病，例如心力衰竭。JPH2對細胞內鈣離子

5、調控系統起核心作用。
　　目的：
　　本研究采用 IonOptix光譜檢測系統記錄培養(yǎng)的單個新生小鼠心肌細胞的鈣瞬變；采用siRNA技術構建針對JPH2基因的重組腺病毒載體，研究重組腺病毒介導的JPH2-siRNA對心肌細胞鈣瞬變的影響，以此探討JPH2在心肌細胞Ca2+調控中的作用。
　　方法：
　　1.實驗所用動物為新生1~3d的 C57BL/6小鼠，生產許可證號為SCXK(京)2012-0001，雌雄不限，

6、均購自于北京維通利華公司。
　　2.實驗所用帶有EGFP標記的重組腺病毒顆粒Ad-JPH2-siRNA及Ad-NC-siRNA（siRNA無關對照腺病毒顆粒）由上海吉凱基因公司包裝完成,并放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩嶒灧譃橐韵?組：（1）正常對照組(Ctrl-NC)，即培養(yǎng)的細胞不加任何處理；（2）無關序列對照組(Ad-NC-siRNA)；（3）重組腺病毒組(Ad-JPH2-siRNA)。
　　3.新生1~3d的C57BL

7、/6小鼠心肌細胞常規(guī)分離培養(yǎng)。培養(yǎng)的新生小鼠心肌細胞分別感染Ad-NC-siRNA與Ad-JPH2-siRNA重組腺病毒。熒光倒置顯微鏡觀察感染36-48h后的感染結果；
　　4.采用IonOptix光譜檢測系統分別對感染腺病毒36h的培養(yǎng)的心肌細胞進行鈣瞬變的檢測：心肌細胞加入終濃度為2μM的Fura-2/AM，置于37℃培養(yǎng)箱避光孵育30 min，有鈣臺氏液清洗，局部電場刺激（電壓8V,1.0Hz,脈寬4ms）誘發(fā)鈣瞬變。Io

8、nOptix光譜檢測系統所用激發(fā)波長340/380 nm。
　　5.采用IonWizard6.6(美國IonOptix公司)軟件分析鈣瞬變的以下指標：BL:Baseline(RU); Peak h:Peak height(RU); Peak t:Time to peak(s);Dep V:Departure velocity(RU/s);Ret V:Returnvelocity(RU/s);TP90％:Time to90% pea

9、k(s);TB90%:Time to90% baseline(s)
　　6．鈣瞬變數據的分析采用IonWizard6.6(美國IonOptix公司)。SPSS21.0軟件對相關實驗數據進行統計學處理，以均數±標準誤(Mean±SEM)表示，同一指標三組間數據的比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間比較用雙側t檢驗，以p<0.05為有顯著性差異。
　　結果：
　　1.培養(yǎng)的新生小鼠心肌細胞在48-72

10、h間長成單層并且形成細胞簇，倒置顯微鏡下觀察到心肌細胞出現自發(fā)的強有力的搏動，證明培養(yǎng)的心肌細胞生長狀態(tài)良好；
　　2.心肌細胞轉染Ad-NC-siRNA與Ad-JPH2-siRNA重組腺病毒36h后，熒光顯微鏡下可觀察到心肌細胞大部分均有EGFP表達；
　　3.IonOptix光譜檢測系統對培養(yǎng)的單個心肌細胞（EGFP表達陽性）分別進行鈣瞬變的測定，Ad-JPH2-siRNA重組腺病毒組與正常對照組(Ctrl-NC)細胞及