睪酮對(duì)小鼠心肌細(xì)胞衰老的干預(yù)作用及其機(jī)制.pdf

1、目的和意義： 世界各國(guó)人口都以不同的速度邁進(jìn)或加速著人類社會(huì)老齡化進(jìn)程，而老年人心血管疾病患病率升高是一個(gè)不容忽視的問(wèn)題。慢性心力衰竭是一種進(jìn)行性的、致命性的復(fù)雜臨床癥候群，是各種心臟病的嚴(yán)重階段，大多數(shù)病程呈進(jìn)行性惡化，發(fā)病率高，病死率甚至高于惡性腫瘤。對(duì)心力衰竭發(fā)病機(jī)制的研究以及防治，一直是心臟病學(xué)界研究的熱點(diǎn)。而心力衰竭的患病率與年齡存在著一定的相關(guān)性。美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)的一項(xiàng)調(diào)查顯示，65歲以上老年人心衰患病率為10‰，是2

2、0至34歲人群的70倍，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他65歲以下人群。接近80%的住院心衰病人是65歲以上的老年人。 研究發(fā)現(xiàn)，作為人體的重要器官，心臟隨增齡會(huì)發(fā)生一系列的變化，稱為心臟衰老。心臟衰老是一個(gè)持續(xù)且不可逆的過(guò)程，其解剖學(xué)表現(xiàn)為心室重量減少和室壁厚度增加。功能學(xué)表現(xiàn)可總結(jié)為心臟儲(chǔ)備能力降低以及對(duì)負(fù)荷的適應(yīng)力下降。具體表現(xiàn)為左室收縮和舒張功能隨增齡而下降，心輸出量峰值下降，最大心率下降；對(duì)兒茶酚胺的反應(yīng)性降低，對(duì)腎上腺素能受體刺激的反

3、應(yīng)降低，對(duì)壓力感受器和化學(xué)感受器的反應(yīng)性下降，而循環(huán)中兒茶酚胺、內(nèi)皮素-1水平升高等。這些都是被廣泛報(bào)道的衰老引起的心臟損害。另外，冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，血管僵硬度增加，內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷，冠狀動(dòng)脈系統(tǒng)和微血管系統(tǒng)相對(duì)缺乏，氧的獲得和利用能力降低，使心肌發(fā)生缺血缺氧。并且，衰老的心臟對(duì)各種不利因素的適應(yīng)性與正常年輕的心臟也不同，如對(duì)心肌缺血，收縮壓升高等病理狀況更為敏感，提示衰老心臟的保護(hù)機(jī)制降低。以上這些證據(jù)說(shuō)明，心臟衰老是老年人心衰患病率

4、升高的主要原因之一。 心臟衰老主要由心肌細(xì)胞的衰老和死亡累積形成。有證據(jù)顯示，老齡大鼠在心衰形成之前，存在有心肌細(xì)胞的衰老和喪失，提示二者之間具有某種聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，心臟中主要的功能細(xì)胞心肌細(xì)胞在衰老過(guò)程中逐漸出現(xiàn)衰老并凋亡，總體數(shù)量持續(xù)減少。健康男性從55歲到95歲，心肌細(xì)胞逐漸喪失，左室平均每年喪失4．5千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，右室喪失1．9千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，這種喪失以凋亡為主要形式，而心肌細(xì)胞的凋亡是心臟衰老的特征之一，屬于心臟衰老過(guò)程的一

5、部分，是衰老心肌細(xì)胞的最終歸宿。心臟剩余的心肌細(xì)胞代償性肥大，而功能逐漸下降，出現(xiàn)動(dòng)作電位延長(zhǎng)，對(duì)β腎上腺素能刺激反應(yīng)減弱，收縮力降低，肌球蛋白重鏈異構(gòu)體改變，肌漿網(wǎng)ATP酶表達(dá)減少，鈉/鈣交換減少，胞漿內(nèi)鈣超負(fù)荷，心肌細(xì)胞興奮-收縮偶聯(lián)失調(diào)，對(duì)應(yīng)激的適應(yīng)力降低，eNOS和iNOS的表達(dá)失調(diào)，凋亡和壞死的易感性增加等一系列改變。以上這些衰老心肌細(xì)胞的改變均可導(dǎo)致心臟功能的降低。在分子水平上，衰老引起心肌細(xì)胞發(fā)生線粒體DNA突變和端?？s短

6、，加劇氧化應(yīng)激，改變基因和蛋白的表達(dá)以及翻譯后修飾，并使NAD（P）H氧化酶升高，蛋白羰基形成，AGE水平升高等等。因此，如果能干預(yù)心肌細(xì)胞的衰老，對(duì)改善心臟器官衰老及預(yù)防心力衰竭的發(fā)生具有重要的意義。 在增齡過(guò)程中，另一個(gè)顯著變化是性激素平衡的改變。睪酮是男性體內(nèi)最重要的雄激素，屬于一種合成激素，研究發(fā)現(xiàn)，男性50歲后體內(nèi)總睪酮及生物活性睪酮水平逐漸出現(xiàn)明顯下降。老年男性血漿睪酮水平與多種增齡相關(guān)性疾病發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)。多項(xiàng)睪酮

7、替代治療的臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，睪酮可改善老年人認(rèn)知能力、調(diào)整肌肉脂肪比例，加強(qiáng)肌肉力量，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力，抑制血脂異常，減少胰島素抵抗，改善性功能等等，但睪酮能否改善老年男性的心功能，延緩老年性心力衰竭的發(fā)生，文獻(xiàn)未見報(bào)道。我們之前的研究表明，睪酮在體外干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞可抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老，但對(duì)心肌細(xì)胞函待研究。 因此，本研究用不同劑量睪酮干預(yù)小鼠心肌細(xì)胞，通過(guò)對(duì)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性和細(xì)胞周期的測(cè)定，探討體外培養(yǎng)28日齡

8、小鼠心肌細(xì)胞是否發(fā)生衰老以及睪酮對(duì)心肌細(xì)胞衰老是否具有干預(yù)作用，并且通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，細(xì)胞周期調(diào)控因子cyclinD1、p16INK4a、去磷酸化Rb的表達(dá)，IGF-1mRNA和蛋白表達(dá)，端粒相對(duì)長(zhǎng)度測(cè)定及線粒體DNA突變率的變化這些可能機(jī)制的研究來(lái)探討心肌細(xì)胞衰老的機(jī)制以及睪酮干預(yù)的可能途徑。 方法： 1、心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及分組：按文獻(xiàn)報(bào)道方法培養(yǎng)昆明白小鼠原代心肌細(xì)胞，鑒定后按以下分組： 1）正常組：3日

9、齡心肌細(xì)胞； 2）衰老組：28日齡心肌細(xì)胞； 3）1μmol/L睪酮組； 4）100nmol/L睪酮組； 5）10nmol/L睪酮組。各睪酮干預(yù)組均自3日齡起加入相應(yīng)濃度睪酮至28日齡止。 2、使用碘化丙啶染色法用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞周期分布，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色法測(cè)定各組染色陽(yáng)性面積。 3、用相應(yīng)方法測(cè)定以下各指標(biāo)： 1）2，7-二氯氫化熒光素二脂（H2DCFH-DA）探

10、針檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平； 2）用RT-PCR及Western-blot法檢測(cè)各組細(xì)胞周期調(diào)控因子cyclinD1，p16INK4amRNA和蛋白表達(dá)以及去磷酸化Rb蛋白表達(dá)； 3）用RT-PCR及Western-blot法檢測(cè)各組IGF-1mRNA和蛋白表達(dá)； 4）定量熒光原位雜交法用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組端粒相對(duì)長(zhǎng)度； 5）提取各組細(xì)胞DNA，用PCR法檢測(cè)各組線粒體DNA突變率。 4、統(tǒng)計(jì)分析

11、：采用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所得數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。各組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間多重比較，采用LSD法。線性相關(guān)性分析采用線性趨勢(shì)檢驗(yàn)。P<0．05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、各組細(xì)胞周期比例及衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性面積： 衰老組28同齡小鼠心肌細(xì)胞G0/G1期比例較正常組3日齡心肌細(xì)胞明顯升高（p=0．000），S期比例明顯降低（p=

12、0．002），G2/M期比例也明顯下降（p=0．000），符合衰老細(xì)胞特征。1μM、100nM、10nM睪酮干預(yù)均可使細(xì)胞G0/G1期比例較衰老組明顯降低（p=0．000； p=0．003和p=0．025），S期比例明顯上升（p=0．000； p=0．002和p=0．041），G2/M期比例也明顯升高（p=0．007； p=0．019和p=0．042）。G0/G1期比例與睪酮?jiǎng)┝康木€性關(guān)聯(lián)性為0．783，S期比例與睪酮?jiǎng)┝康木€性關(guān)聯(lián)性為

13、0．812，G2/M期比例與睪酮?jiǎng)┝康木€性關(guān)聯(lián)性為0．616。 β-半乳糖苷酶染色顯示衰老細(xì)胞胞漿與胞核藍(lán)染，定為陽(yáng)性細(xì)胞。計(jì)算各組染色陽(yáng)性面積比較發(fā)現(xiàn)，衰老組細(xì)胞染色陽(yáng)性面積較正常組明顯升高（p=0．000），符合衰老細(xì)胞特征。1μM、100nM、10nM睪酮干預(yù)使染色陽(yáng)性面積較衰老組明顯降低（p=0．000）。將衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性面積與睪酮干預(yù)濃度進(jìn)行線性趨勢(shì)檢驗(yàn)，二者線性關(guān)聯(lián)性為0．995。 2、用相應(yīng)

14、方法檢測(cè)以下指標(biāo)探討心肌細(xì)胞衰老及睪酮干預(yù)作用機(jī)制 1）各組細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達(dá) 衰老組p161NK4a mRNA表達(dá)較正常組明顯升高（p=0．000），1uM、100nM、10nM睪酮干預(yù)可下調(diào)p16INK4amRNA表達(dá)（p=0．000； p=0．001和p=0．018）。 衰老組cyclinD1mRNA表達(dá)較正常組明顯降低（p=0．000），1uM睪酮可上調(diào)cyclinD1mRNA表達(dá)（p=0．021）。

15、100nM和10nM睪酮干預(yù)無(wú)明顯作用（p=0．569和p=0．640）。 與正常組p16INK4a蛋白表達(dá)相比，衰老組表達(dá)明顯上升（p=0．001），1μM及100nM睪酮可降低p16INK4a蛋白表達(dá)（p=0．013和p=0．045），10nM睪酮對(duì)p16INK4a蛋白表達(dá)無(wú)顯著影響（p=0．642）。 2）各組細(xì)胞IGF-1的表達(dá) 衰老組IGF-1 mRNA表達(dá)較正常組明顯降低（p=0．000），1μM和1

16、00nM睪酮干預(yù)可增強(qiáng)IGF-1 mRNA表達(dá)（p=0．007和p=0．033），但10nM睪酮干預(yù)無(wú)顯著性影響（p=0．098）。 3）各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平 衰老細(xì)胞經(jīng)過(guò)H2DCF-DA染色后可見細(xì)胞呈綠色熒光，各組相對(duì)熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞內(nèi)ROS水平。衰老組細(xì)胞內(nèi)ROS水平較正常組明顯升高（p=0．000），各劑量睪酮干預(yù)（1μM-10nM）均可降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平（p=0．000）。 結(jié)論： 1、與3日

17、齡原代小鼠心肌細(xì)胞相比，經(jīng)體外培養(yǎng)28日齡的小鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞G0/G1期比例升高，S期比例降低，G2/M期比例也降低，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性增強(qiáng)，p16INK4a mRNA和蛋白、去磷酸化Rb蛋白表達(dá)上升，cyclinD1mRNA和蛋白表達(dá)下降，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，平均端粒長(zhǎng)度縮短，線粒體DNA突變率增加，IGF-1 mRNA和蛋白表達(dá)下降等一系列改變，符合衰老細(xì)胞特征，證明自然衰老的小鼠心肌細(xì)胞模型構(gòu)建成功。 2、一