Asxl2對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的影響及其結(jié)合蛋白的鑒定.pdf

1、背景：
　　果蠅Asx（Additional sex combs）基因是ETP（Enhancers of trithorax and Polycomb）基因的一種，其編碼的蛋白能調(diào)節(jié)或招募 Polycomb抑制復(fù)合體（Polycomb-group repressor complex，PRC）和trithorax激活復(fù)合體（trithorax-group activator complex）。Asxl2基因是果蠅Asx基因的哺乳動(dòng)物

2、同源類似物，在2003年被鑒定出來(lái)，之后在乳腺癌，前列腺癌，膀胱癌，胰腺癌等多種人類癌癥中發(fā)現(xiàn)人ASXL2基因的突變。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，Asxl2在哺乳動(dòng)物心臟中高表達(dá)并且對(duì)哺乳動(dòng)物心臟的正常發(fā)育是必需的，Asxl2-/-小鼠的心臟功能出現(xiàn)缺陷。但是關(guān)于Asxl2在疾病中的功能和分子機(jī)制的研究尚不深入。有研究發(fā)現(xiàn)，Asxl2與泛素羧基末端水解酶Bap1（BRCA1 associated protein1）形成一個(gè)復(fù)合體，去除組蛋白H2A

3、第119位賴氨酸單泛素化（H2AK119ub1）的修飾。Asxl2-Bap1復(fù)合體的催化活性與Asxl2功能的關(guān)系需要進(jìn)一步研究。
　　目的：
　　本研究中，我們想要證明Asxl2在小鼠胚胎干細(xì)胞（mouseembryonic stem cells，mESC）向心肌細(xì)胞分化過(guò)程中的作用。并且找到Asxl2結(jié)合蛋白，為闡明其分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。
　　方法：
　　利用CRISPR/Cas9n系統(tǒng)，構(gòu)建Asxl2基因敲除

4、的mESC單克隆細(xì)胞系，提取基因組DNA，genotyping PCR擴(kuò)增出靶位點(diǎn)附近的DNA片段并測(cè)序，Western blot檢測(cè)Asxl2的表達(dá)；利用懸滴法，將野生型mESC和Asxl2基因敲除的mESC單克隆細(xì)胞系向心肌細(xì)胞分化，在分化的2~9天觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，在分化第9天統(tǒng)計(jì)能自發(fā)跳動(dòng)的細(xì)胞團(tuán)所占的比例，在分化第0、2、5天檢測(cè)心肌發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子Mef2c（myocyte enhancer factor2）、Hand1（he

5、art and neural crest derivatives expressed transcript1）的表達(dá)；利用免疫共沉淀法（Co-Immunoprecipitation， Co-IP），在mESC細(xì)胞中檢測(cè)Asxl2結(jié)合蛋白。結(jié)果：
　　第一部分：利用CRISPR/Cas9n系統(tǒng)構(gòu)建Asxl2基因穩(wěn)定敲除的mESC單克隆細(xì)胞系
　　1.成功構(gòu)建靶向Asxl2基因的CRISPR/Cas9n重組質(zhì)粒。
　　2.

6、將2個(gè)重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 mESC細(xì)胞，嘌呤霉素篩選后得到亞克隆細(xì)胞系，經(jīng)genotyping PCR擴(kuò)增出靶位點(diǎn)附近的序列并測(cè)序，驗(yàn)證得到一株Asxl2基因突變的單克隆細(xì)胞系。
　　3.Western blot證實(shí)該mESC單克隆細(xì)胞系中Asxl2表達(dá)缺失。
　　第二部分：Asxl2基因是mESC向心肌細(xì)胞分化所必需的
　　1.Asxl2基因穩(wěn)定敲除的mESC單克隆細(xì)胞系與野生型mESC細(xì)胞相比，在向心肌分化過(guò)程中，表型

7、發(fā)生改變。
　　2.Asxl2基因穩(wěn)定敲除的mESC單克隆細(xì)胞系與野生型mESC細(xì)胞相比，在分化第9天能形成自發(fā)節(jié)律性收縮的細(xì)胞團(tuán)比例減少。
　　3.Asxl2基因穩(wěn)定敲除的mESC單克隆細(xì)胞系與野生型mESC細(xì)胞相比，在分化過(guò)程中心肌發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子Mef2c、Hand1的表達(dá)下降。
　　第三部分：在體內(nèi)，Asxl2與Bap1能結(jié)合，而不與Ezh2結(jié)合
　　結(jié)論：
　　1.小鼠胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的過(guò)程中