中國明對蝦C-型凝集素的重組表達(dá)和功能分析以及對蝦素與防御素融合抗菌肽表達(dá)載體構(gòu)建、重組表達(dá)和性質(zhì)分析.pdf

1、中國對蝦是我國重要的海產(chǎn)養(yǎng)殖品種，具有重要的經(jīng)濟(jì)地位。大規(guī)模的養(yǎng)殖使對蝦傳染性疾病頻發(fā)，造成重大經(jīng)濟(jì)損失，因而，找到有效預(yù)防和診斷治療對蝦疾病的方法迫在眉睫。利用一系列的生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法，研究對蝦先天免疫相關(guān)基因C-型凝集素及其功能，能夠在一定層面上提供對蝦免疫機(jī)制的認(rèn)識，為對蝦疾病的防治提供理論依據(jù)。針對海水養(yǎng)殖業(yè)病害發(fā)生的現(xiàn)狀，從篩選和克隆海洋動物抗病功能基因-抗菌肽基因入手，應(yīng)用基因工程手段獲得抗菌肽融合基因，以期研制安全

2、、高效、廣譜的抗細(xì)菌、抗病毒的重組抗病蛋白漁藥，從而減少養(yǎng)殖病害發(fā)生，提高水產(chǎn)品質(zhì)量，保障水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展。 本論文主要報道了中國明對蝦先天免疫中重要的模式識別蛋白(patternrecognition proteins，PRPs)C-型凝集素的重組表達(dá)及功能分析；利用基因工程手段獲得融合表達(dá)抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)并研究其抗菌功能。主要結(jié)果如下： 1.中國明對蝦C-型凝集素的

3、重組表達(dá)和功能分析無脊椎動物通過模式識別受體識別病原微生物細(xì)胞表面特異保守的糖分子，從而能夠識別入侵微生物。C-型凝集素屬于模式識別蛋白，在對蝦先天免疫中起重要作用。本實驗室從中國明對蝦中克隆得到一種新型的C-型凝集素，命名為Fc-hsL，并發(fā)現(xiàn)其與免疫聯(lián)系緊密。 本論文在原核表達(dá)系統(tǒng)中大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白Fc-hsL，利用純化的重組蛋白進(jìn)行了一系列性質(zhì)研究。凝集實驗證明，F(xiàn)c-hsL成熟肽在鈣離子存在情況下可以凝集革蘭氏陽性

4、菌和革蘭氏陰性菌，包括：巨大芽孢桿菌，大腸桿菌等。細(xì)菌結(jié)合實驗發(fā)現(xiàn)，重組蛋白可以結(jié)合巨大芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌，以及部分革蘭氏陰性菌，如革蘭氏陰性菌大腸桿菌和肺炎克雷伯氏桿菌。通過進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)c-hsL對甘露糖、半乳糖、脂多糖等都有結(jié)合能力，對甘露糖的結(jié)合能力大于對半乳糖的結(jié)合能力。通過管碟法和液體生長抑制實驗等方法測試重組蛋白的抑菌活性和最小抑菌濃度(MIC)，發(fā)現(xiàn)其對革蘭氏陽性菌和真

5、菌的抑菌能力較強(qiáng)，對革蘭氏陰性菌有一定的抑菌能力。 2.融合抗菌肽表達(dá)載體構(gòu)建、重組表達(dá)和性質(zhì)分析抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是先天免疫系統(tǒng)重要的組成成分。本實驗室從家蠅(Musca domestica)中克隆得到的防御素(Musca sticadefensin，Mdde)具有抗革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌的活性(Wang et aL，2006)。中國明對蝦對蝦素(penaeidin 5)是

6、本實驗室從其血細(xì)胞中克隆得到的，對革蘭氏陽性菌，陰性菌和真菌有抗性，最小抑菌濃度(MIC)分別：6.3-25.0μM，12.5-50μM，6.25-12.5μM(Kang et aL，2007)。 本論文通過重疊延伸PCR的方法將中國明對蝦對蝦素-5(penaeidin 5)和家蠅防御素Mdde基因片段融合，構(gòu)建表達(dá)載體pET30a-pen-mdde。這個方法的核心就在于設(shè)計兩對引物。首先位于融合基因后端的Mdde的前引物引入p

7、enaeidin5末端的22個核苷酸：其次penaeidin 5的前引物和Mdde的后引物引入EcoR1和XhoI酶切位點。本論文成功地在大腸桿菌中大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)，并純化得到了融合蛋白。利用管碟法和液體生長抑制法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)重組蛋白有抗菌活性，對革蘭氏陽性菌，陰性菌和真菌的最小抑菌濃度分別為：0.3-2.4μM，1.2-2.4μM，0.3-2.7μM。和單獨的抗菌肽相比，融合蛋白對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌以及真菌的抗性都大大增強(qiáng)，例

8、如：對蝦素-5抑制革蘭氏陽性菌，陰性菌和真菌所需最小的濃度分別為：6.3μM，12.5μM，6.25μM(Kang et aL，2007)，而融合蛋白重組蛋白為：0.3μM，1.2μM，0.3μM，其中，對真菌蘋果炭疽菌(Glomerella album)和革蘭氏陽性菌蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)的最小抑菌濃度為0.3μM。而且融合蛋白保留了對蝦素penaein5和家蠅防御素Mdde對革蘭氏陽性菌的抗性大于