微弧氧化載銀處理的Ti6A14V鈦合金對人牙齦成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、臨床上種植義齒在缺失牙患者的治療中適應(yīng)證廣泛，近幾十年種植義齒更是迅速發(fā)展，越來越多的缺牙患者開始選擇種植義齒修復(fù)，種植學(xué)也成為了口腔學(xué)科中發(fā)展最為迅速的二級學(xué)科，種植義齒的出現(xiàn)甚至改變了傳統(tǒng)的缺牙修復(fù)治療模式。種植體周圍炎（又稱種植體周圍黏膜炎）是指發(fā)生在口腔種植體周圍軟組織的可逆炎癥。其發(fā)生發(fā)展的根本因素是寄生在種植體上的細(xì)菌微生物。由于口腔衛(wèi)生不良，種植體周圍菌斑堆積，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。臨床上患者表現(xiàn)為黏膜的紅腫、探診出血

2、甚至溢膿等癥狀。其一般發(fā)生在種植體植入之后或行使功能之后，發(fā)生于種植體周圍組織的慢性炎癥，多導(dǎo)致種植體周圍支持骨吸收，其發(fā)展的最終歸宿是種植體脫落。良好的骨整合與種植體頸部良好的軟組織附著所形成的“袖口”封閉是維持種植體長期穩(wěn)定的生物學(xué)基礎(chǔ)，是抵抗種植體周圍炎的關(guān)鍵?！靶淇凇苯Y(jié)構(gòu)的形成，可以起到生物學(xué)屏障作用，能夠有效阻止細(xì)菌及其他致炎因子的入侵，預(yù)防種植體周圍炎的發(fā)生，減少骨組織吸收，提高臨床種植義齒成功率。本實(shí)驗(yàn)意在探討一種更有利于

3、牙齦成纖維細(xì)胞附著的愈合基臺表面處理方法，為愈合基臺一種表面臨床改良提供可行的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　種植體可以長期穩(wěn)定存在于口腔環(huán)境并良好的行使作用，“骨結(jié)合”必不可少，其中種植體穿齦部分也起著至關(guān)重要的作用。雖然種植體周圍結(jié)合上皮和天然牙周圍結(jié)合上皮類似，以半橋粒與基底板附著在種植體表面，但是種植體和結(jié)締組織的結(jié)合方式一直存在著爭議。牙齦結(jié)締組織里牙齦成纖維細(xì)胞占最主要作用，本實(shí)驗(yàn)擬研究微弧氧化處理和微弧氧化載銀處理的Ti6Al4V合

4、金對牙齦成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響，引導(dǎo)探索一種有利于袖口形成的愈合基臺的表面處理方法，具有一定臨床意義。
　　第一章 人牙齦成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　目的:
　　體外分離培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞(Human Gingival Fibroblasts，HGFs)，觀察人牙齦成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)特點(diǎn)，對其來源進(jìn)行鑒定，為接下來的實(shí)驗(yàn)提供細(xì)胞基礎(chǔ)。
　　方法:
　　選擇就診于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院正畸科且需要

5、拔牙進(jìn)行矯正治療的年輕患者，年齡12～20歲，要求患者牙齦健康、無齲齒、無牙齦增生且未服用可使牙齦增生的藥物。征得其同意并簽署知情同意書后局部麻醉下拔除正畸牙同時(shí)切取牙齦組織，采用酶消化組織塊法對其進(jìn)行原代培養(yǎng)，并通過免疫組織化學(xué)染色對其來源進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果:
　　1.顯微鏡下可觀察到原代細(xì)胞在培養(yǎng)到第3-5d左右時(shí)從黑色組織塊邊緣向四周游出，細(xì)胞緊貼培養(yǎng)瓶壁生長，細(xì)胞形態(tài)多呈長梭形，胞體豐滿，胞漿均勻，可見到單顆細(xì)胞核

6、位于胞漿中央呈橢圓形，其內(nèi)可見含2-3個(gè)核仁。伴隨培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞從組織塊中央向四周伸展，以組織塊為中心呈現(xiàn)放射狀排列，排列緊密，細(xì)胞呈極性排列。到觀察到細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底約90％面積左右時(shí)可看見HGFs胞體排列緊密呈細(xì)長梭形，細(xì)胞排列呈旋渦狀與編織狀，傳代培養(yǎng)后的牙齦成纖維細(xì)胞生長旺盛，上皮細(xì)胞逐漸消失，性狀趨于穩(wěn)定。
　　2.在光鏡下對細(xì)胞行免疫組化染色觀察，細(xì)胞表現(xiàn)出抗波形絲蛋白染色陽性，胞質(zhì)內(nèi)陽性顆粒分布均勻，胞核清晰、

7、無染色;抗角蛋白染色陰性，證明細(xì)胞來源于中胚層，且無上皮源性細(xì)胞混雜。陰性對照組均未見陽性染色結(jié)果。說明培養(yǎng)的細(xì)胞來源于間充質(zhì)而非上皮源性細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)通過組織塊法成功培養(yǎng)出HGFs，并通過免疫組織化學(xué)對其進(jìn)行了鑒定，這些細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，可以在體外維持較長時(shí)間，足以滿足本接下來研究所需。
　　第二章 微弧氧化與微弧氧化載銀處理的Ti6Al4V鈦合金理化性能的研究
　　目的:
　　使用掃描電

8、鏡(SEM)、表面元素分析儀、表面粗糙度儀、接觸角測量儀檢測微弧氧化與微弧氧化載銀處理后的Ti6Al4V鈦合金表面形貌特點(diǎn)、元素組成、表面粗糙度水平和表面接觸角大小水平。
　　方法:
　　購置8mm直徑、0.8mm厚度的Ti6Al4V合金片;以Ti6Al4V鈦合金作為陽極，鉑電極作為陰極，采用350V恒壓，設(shè)置頻率50Hz，設(shè)置占空比50％，在冰塊冷卻作用下使電解液溫度保持在在40℃以下處理5min。試樣經(jīng)微弧氧化后用去離子

9、水超聲洗滌15min，放入烘干箱，烘干干燥紙塑密封包裝備用。配制為0.006mol/L濃度硝酸銀溶液作電解液，鉑電極作為陽極、微弧氧化處理后的試樣作作為陰極，硝酸銀溶液做電解液，設(shè)置2V電壓使試樣在電解液中處理30s，對鈦合金片作電沉積載銀處理（處理過程中均勻攪拌電解液），超聲清洗后干燥，得到載銀微弧氧化試樣。使用掃描電鏡(SEM)觀察處理后試樣表面形貌、結(jié)構(gòu);使用表面元素分析儀分析處理后試樣表面元素組成;使用表面粗糙度測量儀測量試件表

10、面糙度，測量處理試樣表面液體接觸角并計(jì)算材料表面自由能。
　　結(jié)果:
　　掃描電鏡觀察微弧氧化后鈦合金片表面，可觀察到粗糙多孔氧化陶瓷，呈“火山口”形貌，“火山口”孔徑約2-5μm。檢測Ti6A14V-MAO以及Ti6Al4V-MAO-Ag表面粗糙度得知粗糙度為微米級。進(jìn)行表面接觸角檢測，發(fā)現(xiàn)Ti6Al4V-MAO以及Ti6Al4V-MAO-Ag組均小于光滑組。
　　結(jié)論:
　　經(jīng)微弧氧化與微弧氧化載銀處理后的T

11、i6Al4V合金表面形成了“火山口”狀特殊形貌，其粗糙度加大，處理后所表面水接觸角更小，表面元素及元素比例發(fā)生變化。
　　第三章 微弧氧化Ti6Al4V鈦合金載銀對人牙齦成纖維細(xì)胞早期黏附、細(xì)胞形態(tài)及增殖的影響
　　目的:
　　研究微弧氧化Ti6Al4V鈦合金載銀對人牙齦成纖維細(xì)胞早期黏附、細(xì)胞形態(tài)及增殖的影響。
　　方法:
　　于光滑的Ti6Al4V鈦合金，Ti6Al4V-MAO以及Ti6Al4V-MAO

12、-Ag表面分別接種原代培養(yǎng)的人牙齦成纖維細(xì)胞，通過掃描電鏡、CCK-8、熒光正置顯微鏡等方法檢測觀察HGFs的早期黏附、增殖情況及細(xì)胞形態(tài)。
　　結(jié)果:
　　1.細(xì)胞早期黏附:在光滑Ti6Al4V鈦合金、Ti6Al4V-MAO以及Ti6Al4V-MAO-Ag表面分別接種人牙齦成纖維細(xì)胞細(xì)胞，接種細(xì)胞12h，24h后用DAPI染料及熒光抗體分別對其細(xì)胞核與細(xì)胞骨架進(jìn)行染色處理，熒光顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)。12h，24h后Ti6A

13、l4V-MAO組以及Ti6Al4V-MAO-Ag組表面細(xì)胞數(shù)量明顯多于光滑組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　2.細(xì)胞形態(tài):熒光正置顯微鏡下觀察經(jīng)熒光染色處理的HGFs接種在光滑Ti6Al4V鈦合金、Ti6Al4V-MAO組與Ti6Al4V-MAO-Ag組表面12h后的細(xì)胞骨架形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)牙齦成纖維細(xì)胞在光滑鈦合金表面沿著拋光試樣時(shí)的紋路排列，呈梭型排開，細(xì)胞呈現(xiàn)出極性排列方式。而Ti6Al4V-MAO與Ti6Al4V-MA

14、O-Ag組表面細(xì)胞呈紡錘型生長，細(xì)胞鋪展而積較大。掃描電鏡觀察可見在牙齦成纖維細(xì)胞與試樣恒溫共培養(yǎng)12h之后細(xì)胞延材料表面砂紙打磨痕跡單向極性伸展，呈梭型與條狀。而MAO與MAO-Ag組共培養(yǎng)牙齦成纖維細(xì)胞伸出偽絲和絲狀偽足。繼續(xù)培養(yǎng)至24h后可見到光滑組細(xì)胞有多方向伸展變化，MAO與MAO-Ag組牙齦成纖維細(xì)胞伸展面積明顯增大。
　　3.細(xì)胞增殖:使用CCK8法檢測HGFs接種在對對照組、光滑組、MAO組以及MAO-Ag組表面1