骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、增生性瘢痕(hypertrophic scar)和瘢痕疙瘩(keloid)是臨床上常見的一種疾病，是皮膚真皮層在創(chuàng)傷愈合過程當(dāng)中成纖維細(xì)胞等組織修復(fù)細(xì)胞過度增殖、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度合成為特點(diǎn)的纖維化疾病。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩在臨床表現(xiàn)上存在差異，增生性瘢痕通常高于皮膚表面，呈紅色或粉紅色，有瘙癢，發(fā)展時(shí)限通常長(zhǎng)于正常瘢痕，通常超過1年，但不會(huì)超過原發(fā)的傷口邊緣，以后漸漸萎縮，形成萎縮性瘢痕

2、;而瘢痕疙瘩還具有侵襲性，能持續(xù)性生長(zhǎng)，并侵入周圍正常批復(fù)組織中，不能隨時(shí)間而自行改善。到目前為止，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制仍不明確，因此臨床上對(duì)瘢痕疙瘩與增生性瘢痕也無令人滿意的治療方法。當(dāng)前的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcells，MSCs)可以促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合，減少瘢痕形成。然而，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)治

3、療對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（hypertrophic scar fibroblasts，HSFs）和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(keloidfibroblasts，KFs)的生物學(xué)行為的影響尚無明確研究。本研究以BMSCs的細(xì)胞培養(yǎng)基制作BMSC條件培養(yǎng)基，以BMSC條件培養(yǎng)基處理培養(yǎng)HSFs和KFs，并萎縮性瘢痕成纖維細(xì)胞（matured scar fibroblasts，MSFs）和正常皮膚成纖維細(xì)胞（normal skin fibrobla

4、sts，NFs）及NF條件培養(yǎng)基和含PBS條件培養(yǎng)基作為對(duì)照，觀察BMSC條件培養(yǎng)基對(duì)HSFs和KFs在細(xì)胞增殖表型、纖維化表型和細(xì)胞外基質(zhì)合成等方面的影響。
　　目的：
　　檢測(cè)BMSC條件培養(yǎng)基處理培養(yǎng)，對(duì)HSFs和KFs在細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、纖維化疾病相關(guān)基因的表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)合成等方面的影響，探討B(tài)MSC旁分泌功能對(duì)增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的BMSC細(xì)胞治療研究提供理論

5、基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.獲取人骨髓標(biāo)本，以全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)人BMSCs，取第二代BMSCs擴(kuò)增培養(yǎng)48h，獲取BMSC細(xì)胞培養(yǎng)基制作BMSC條件培養(yǎng)基;
　　2.獲取人正常皮膚、萎縮性瘢痕、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩標(biāo)本，膠原酶消化法分別分離培養(yǎng)NFs、MSFs、HSFs和KFs;
　　3.取第二代NFs擴(kuò)增培養(yǎng)48h，獲取的NF細(xì)胞培養(yǎng)基制作NF條件培養(yǎng)基;配制含PBS的條件培養(yǎng)基;
　　4.分別以

6、BMSC條件培養(yǎng)基、NF條件培養(yǎng)基和含PBS的條件培養(yǎng)基處理培養(yǎng)NFs、MSFs、HSFs和KFs四類成纖維細(xì)胞一定時(shí)間，分別以CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖曲線、細(xì)胞劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移、TUNEL染色法檢測(cè)凋亡;
　　5.分別以BMSC條件培養(yǎng)基、NF條件培養(yǎng)基和含PBS的條件培養(yǎng)基處理培養(yǎng)NFs、MSFs、HSFs和KFs四類成纖維細(xì)胞一定時(shí)間，分別以real-timePCR法檢測(cè)纖維化疾病相關(guān)基因在mRNA水平的表達(dá)，以In-ce

7、ll westernblot法和免疫熒光染色法檢測(cè)纖維化疾病相關(guān)基因在蛋白水平的表達(dá);
　　6.分別以BMSC條件培養(yǎng)基、NF條件培養(yǎng)基和含PBS的條件培養(yǎng)基處理培養(yǎng)NFs、MSFs、HSFs和KFs四類成纖維細(xì)胞一定時(shí)間，分別以real-timePCR法檢測(cè)Ⅰ型膠原和纖連蛋白在mRNA水平的表達(dá)，以In-cell westernblot法和免疫熒光染色法檢測(cè)Ⅰ型膠原和纖連蛋白在蛋白水平的表達(dá);以細(xì)胞培養(yǎng)基中羥脯氨酸含量法檢測(cè)成纖

8、維細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)合成。
　　結(jié)果：
　　1.人BMSC條件培養(yǎng)基抑制HSFs和KFs增殖、遷移，但不影響HSFs和KFs的凋亡;
　　2.人BMSC條件培養(yǎng)基抑制HSFs和KFs表達(dá)促纖維化表型相關(guān)基因和蛋白，如CTGF、PAI-1、TGF-β1和TGF-β2;
　　3.人BMSC條件培養(yǎng)基促進(jìn)HSFs和KFs表達(dá)抗纖維化表型相關(guān)基因和蛋白，如Decorin和TGF-β3;
　　4.人BMSC條件培養(yǎng)基抑制

9、HSFs和KFs合成細(xì)胞外基質(zhì)，表現(xiàn)為抑制HSFs和KFs內(nèi)Ⅰ型膠原和纖連蛋白的表達(dá)，抑制HSFs和KFs合成羥脯氨酸。
　　結(jié)論：
　　1.人BMSC條件培養(yǎng)基抑制HSFs和KFs的增殖表型;
　　2.人BMSC條件培養(yǎng)基抑制HSFs和KFs的纖維化表型;
　　3.人BMSC條件培養(yǎng)基抑制HSFs和KFs的細(xì)胞外基質(zhì)合成。
　　創(chuàng)新：
　　首次使用BMSC條件培養(yǎng)基處理培養(yǎng)影響HSFs和KFs的增殖