通過檢測(cè)堿性磷酸酶和骨鈣素2的表達(dá)水平定量分析組織工程骨成骨影響因素.pdf

1、目的:
　　大塊骨損傷是目前重建手術(shù)的巨大挑戰(zhàn)。目前，臨床上常用的治療方法包括自體骨移植，異體骨移植和人工材料單獨(dú)或結(jié)合骨移植。然而，自體骨移植材料來源有限且可導(dǎo)致供體損傷。異體骨移植有導(dǎo)致免疫反應(yīng)、疾病傳播和炎癥的風(fēng)險(xiǎn)。近年來組織工程骨技術(shù)治療骨缺損的研究吸引了人們的注意。組織工程骨技術(shù)有三個(gè)關(guān)鍵元素:(1)細(xì)胞(2)生長(zhǎng)因子(3)支架。同時(shí)，組織工程骨的生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)成骨也有很大的影響。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種可以分化為

2、成骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，肌腱細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的多能干細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以在骨髓提取并在體外迅速擴(kuò)增，因此被廣泛用做種子細(xì)胞。富血小板血漿富含可以影響骨再生的生長(zhǎng)因子。當(dāng)被激動(dòng)劑例如凝血酶激活時(shí)，富血小板血漿可以釋放這些細(xì)胞因子。支架材料在組織工程骨技術(shù)中有關(guān)鍵性的作用，β-磷酸三鈣生物支架材料具有高生物相容性，良好的生物可吸收性和可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化增殖等優(yōu)點(diǎn)。灌注型生物反應(yīng)器可以模擬生物內(nèi)環(huán)境和創(chuàng)建一個(gè)三維立體空間，來促進(jìn)細(xì)胞的粘附、增

3、殖和分化。成骨分化早期的重要參考指數(shù)為ALP的表達(dá)水平。此外，ALP在骨的鈣化過程中起著十分重要的作用，常被認(rèn)為是成熟的成骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶。在體外成骨試驗(yàn)中，ALP濃度的定量檢測(cè)常被用作早期成骨份化的常規(guī)性標(biāo)志物。Bglap2作為成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志物，主要在骨細(xì)胞鈣化期出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用灌注型生物反應(yīng)器，利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和β-磷酸三鈣生物材料支架在體外構(gòu)建組織工程骨，并利用富血小板血漿作為成骨誘導(dǎo)中生長(zhǎng)因子的來源，將以上因素相互組合成

4、不同實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，植入兔皮下，通過檢測(cè)不同組合構(gòu)建的復(fù)合體其ALP和Bglap2的表達(dá)水平，評(píng)估以上各因素在組織工程骨成骨中的促進(jìn)作用。
　　方法:
　　1.取2-3月齡的健康的新西蘭大白兔，麻醉好后放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，備皮，固定，消毒，鋪無菌巾，在無菌條件下用穿刺針抽取雙側(cè)脛骨平臺(tái)內(nèi)下側(cè)骨髓5ml,梯度密度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行原代、傳代細(xì)胞培養(yǎng)。流式細(xì)胞儀鑒定。
　　2.制備富血小板血漿。經(jīng)兔耳緣

5、靜脈抽取新鮮血液約5ml，在無菌條件下，迅速加入到盛有1ml5％枸櫞酸鈉的10ml離心管中，輕輕搖晃，防止凝固。將上述離心管中的血液放入離心機(jī)中，采用二次離心法制備富血小板血漿，第一次離心3300rpm，第二次離心3000rpm，然后得到無色透明的膠凍狀物質(zhì)即是富血小板血漿。
　　3.將第三代兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，將制備的細(xì)胞懸液滴加到β-磷酸三鈣支架材料上，上下翻轉(zhuǎn)支架材料，這樣可以使支架材料的每部分都有細(xì)胞接觸，滴

6、加好細(xì)胞懸液后，向每個(gè)培養(yǎng)孔板中追加3ml的細(xì)胞培養(yǎng)基，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，過夜。將上述制備的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與β-磷酸三鈣(β-TCP)支架復(fù)合體置入含有或不含有富血小板血漿的生物反應(yīng)器灌注柱內(nèi)，最后，將生物反應(yīng)器整套系統(tǒng)置入37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)3周。放置好后調(diào)節(jié)流速為3ml/min,沒2-3天換一次培養(yǎng)液。電鏡下觀察生物支架及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附、增殖和生長(zhǎng)。我們將構(gòu)建的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合支架材料分成

7、五組:A組:富血小板血漿+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞+β-磷酸三鈣+生物反應(yīng)器B組:富血小板血漿+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞+β-磷酸三鈣C組:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞+β-磷酸三鈣+生物反應(yīng)器D組:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞+β-磷酸三鈣E組:β-磷酸三鈣。
　　4.將在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的復(fù)合體取出，植入到大白兔腰部的深淺筋膜之間，縫合，并記錄其位置，三個(gè)月以后，處死大白兔取出復(fù)合體材料，將復(fù)合體材料上的細(xì)胞分離并進(jìn)行定量PCR以檢測(cè)細(xì)胞中骨鈣素和堿性磷酸酶的表達(dá)。

8、
　　5.定量PCR重復(fù)三次。所得計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，數(shù)據(jù)使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行各組之間的單因素方差分析或t檢驗(yàn)，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.使用倒置相差顯微鏡鏡下觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可見接種后3天出現(xiàn)少量細(xì)胞粘附貼壁，此時(shí)細(xì)胞呈現(xiàn)梭形。培養(yǎng)7天后觀察到細(xì)胞集落的出現(xiàn)，傳代培養(yǎng)7天后觀察到細(xì)胞形成漩渦狀集落。
　　2.使用流式細(xì)胞儀對(duì)經(jīng)過2次傳代后的骨

9、髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果示2％的細(xì)胞為CD34陽性，98％的細(xì)胞為CD44陽性。
　　3.電鏡下可見骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在三維支架材料上良好的粘附和分布。
　　4.實(shí)驗(yàn)組因骨鈣素2(BGLAP2)、堿性磷酸酶(ALP)基因的表達(dá)明顯高于其他組。實(shí)驗(yàn)組之間的比較也表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是組織工程中較理想的種子細(xì)胞。
　　2.自體富血小板血漿能夠有效誘導(dǎo)成骨。
　　3.骨