血管化組織工程骨修復(fù)兔骨缺損對缺損處CGRP和NPY表達(dá)影響.pdf

1、研究目的： 創(chuàng)傷與腫瘤等疾病所致的骨缺損修復(fù)一直是十分棘手的難題，骨組織工程技術(shù)的發(fā)展為解決此類問題開辟了一條途徑，但是如何構(gòu)造大塊的組織工程骨、促進(jìn)其在體內(nèi)存活仍是一道難題。充分的血液供應(yīng)和完善的神經(jīng)支配是保證組織工程化骨組織體內(nèi)存活的決定性因素，前者為其提供充足的營養(yǎng)和氧分，后者所分泌的神經(jīng)肽則對成骨有重要的影響。當(dāng)前學(xué)者們已經(jīng)建立了很多構(gòu)建血管化組織工程骨的方法，例如單純的血管束植入或帶血管蒂筋膜瓣包裹組織工程骨都能明顯促

2、進(jìn)組織工程骨的血管化，但是促進(jìn)神經(jīng)化的方法就很少。因此，本實(shí)驗(yàn)利用股血管束植入組織工程骨修復(fù)兔股骨缺損和帶血管蒂筋膜瓣包裹組織工程骨修復(fù)兔橈骨骨缺損兩種方法，研究血管化組織工程骨對修復(fù)部位神經(jīng)肽CGRP和NPY表達(dá)的影響，為其在臨床的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法： 第一部分單純血管束、神經(jīng)束分別植入組織工程骨修復(fù)兔股骨缺損對CGRP和NPY表達(dá)影響的比較 1.新西蘭大白兔36只，體重2.0-2.5kg，雄性

3、。抽取自體骨髓，在體外培養(yǎng)擴(kuò)增骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。第4代時(shí)將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞按4×106-6×106個(gè)／ml的密度接種到直徑8mm、帶側(cè)槽的、多孔β-磷酸三鈣支架上構(gòu)建組織工程骨，體外培養(yǎng)7d后備用。所有動(dòng)物均于右側(cè)后肢股骨前外側(cè)做一縱形切口，分離顯露股骨。股骨前側(cè)放置已塑形好的4孔普通鋼板，于鋼板第2、3孔之間截取1.5cm長股骨，骨缺損處嵌入組織工程骨后依次縫合傷口。再于股骨內(nèi)側(cè)中央做一小的縱切口，逐層切開，在股三角內(nèi)顯露和分離出大隱神經(jīng)

4、和股血管束，將股血管束游離適當(dāng)距離后植入組織工程骨側(cè)槽中并用線固定為A組(組織工程骨+股血管束植入組)；將大隱神經(jīng)游離適當(dāng)長度后銳性切斷并植入組織工程骨的側(cè)槽內(nèi)，為B組(組織工程骨+感覺神經(jīng)束植入組)；不植入神經(jīng)和血管束的為C組。 2.分別于術(shù)后3、6、12個(gè)月處死每組4只動(dòng)物，完整截取骨缺損側(cè)股骨，行大體標(biāo)本觀察。以40g／L的多聚甲醛固定，150g/L的乙二胺四乙酸脫鈣后石蠟包埋，連續(xù)做5μm厚橫行及縱行切片，并選取每個(gè)標(biāo)本

5、橫行切片兩張和縱行切片兩張，對其中的降鈣素基因相關(guān)肽和神經(jīng)肽Y進(jìn)行免疫組化染色。用圖像分析軟件測定陽性染色的積分光密度值。 利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用3×3析因設(shè)計(jì)方差分析對處理因素和時(shí)間的主效應(yīng)和交互效應(yīng)做統(tǒng)計(jì)，若有顯著性差異則用單向方差分析(One-wayANOVA)對同一時(shí)間點(diǎn)各組間的IOD值和同一組間不同時(shí)間點(diǎn)的IOD值行比較，并用LSD法行多重比較分析。P≤0.05為具有顯著性差異。

6、第二部分帶血管蒂筋膜瓣包裹組織工程骨修復(fù)兔橈骨缺損對CGRP和NPY表達(dá)影響的比較 1.新西蘭大白兔18只，體重2.0-2.Skg，雄性。抽取自體骨髓，在體外培養(yǎng)擴(kuò)增骨髓基質(zhì)干細(xì)胞至第4代時(shí)，將其按4×106-6×106個(gè)／ml的密度接種到直徑4mm、多孔β-磷酸三鈣圓柱型支架上構(gòu)成組織工程骨細(xì)胞材料復(fù)合體，體外培養(yǎng)7d后備用。所有動(dòng)物在戊巴比妥靜脈麻醉基礎(chǔ)上，于左、右兩側(cè)的前肢內(nèi)側(cè)作一切口，分離顯露橈骨。在橈骨中段制作1.5c

7、m長的骨與骨膜缺損，并在骨缺損處嵌入組織工程骨。在制作動(dòng)物模型時(shí)，在骨缺損附近尋找一寬大的深筋膜并游離，制作成約2x1.5cm的帶血管蒂筋膜瓣，繼而將筋膜瓣翻轉(zhuǎn)包裹組織工程骨后依次縫合傷口，為A組。制作缺損后取16＃醫(yī)用硅膠導(dǎo)尿管的氣囊部分，修剪成2×1.5cm，放置在缺損處橈骨與尺骨間，放置組織工程骨后用縫線閉合硅膠膜開口，注意硅膠膜必須覆蓋橈骨兩斷端各2.0mm，此為B組。缺損模型中僅放置組織工程骨的為C組。 2.分別于術(shù)后

8、3、6、12個(gè)月處死每組2只動(dòng)物，完整截取骨缺損側(cè)骨，行大體標(biāo)本觀察。以40g／L的多聚甲醛固定，150g／L的乙二胺四乙酸脫鈣后石蠟包埋，連續(xù)做5μm厚橫行及縱行切片，并選取每個(gè)標(biāo)本橫行切片兩張和縱行切片兩張，對其中的降鈣素基因相關(guān)肽和神經(jīng)肽Y進(jìn)行免疫組化染色。用圖像分析軟件測定陽性染色的積分光密度值。 利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用3x3析因設(shè)計(jì)方差分析對處理因素和時(shí)間的主效應(yīng)和交互效應(yīng)做統(tǒng)計(jì)，若有顯著

9、性差異則用單向方差分析對同一時(shí)間點(diǎn)各組間的IOD值和同一組間不同時(shí)間點(diǎn)的IOD值行比較，并用LSD法行多重比較分析。P≤0.05為具有顯著性差異。 結(jié)果： 第一部分單純血管束、神經(jīng)束分別植入組織工程骨修復(fù)兔骨缺損對CGRP和NPY表達(dá)影響的比較 1.CGRP免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果對植入物區(qū)新生骨組織內(nèi)的CGRP的IOD值行3×3析因設(shè)計(jì)方差分析顯示，隨著時(shí)間的增加，各組新生骨組織內(nèi)的CGRP的表達(dá)量都有不同程度的增

10、加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在同一時(shí)間點(diǎn)三組之間也存在有顯著性差異，用One-wayANOVA和LSD法統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，3個(gè)月時(shí)A組比B組顯著增加，且兩者都多于C組；6個(gè)月和12個(gè)月時(shí)，A組和B組的量顯著比C組多，但A、B組無顯著性差異。3個(gè)月時(shí)，A、B兩組CGRP表達(dá)位置大致相同，多在血管和骨髓處，新生骨邊緣和骨膜處也有少量陽性表達(dá)，但C組只在灶狀骨髓周圍發(fā)現(xiàn)有少量表達(dá)。隨著時(shí)間增加，三組在血管周圍、骨髓內(nèi)、骨膜上的表達(dá)量也增加，但6個(gè)月和1

11、2個(gè)月時(shí)，CGRP的分布位置以骨膜處和血管周圍最多。 2.NPY免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果對植入物區(qū)新生骨組織內(nèi)的NPY的IOD值行3×3析因設(shè)計(jì)方差分析顯示，隨著時(shí)間的增加，各組新生骨組織內(nèi)的NPY的表達(dá)量都有不同程度的增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為1659.948，1395.471，610.540，均為P<0.001)；而在同一時(shí)間點(diǎn)三組之間也存在有顯著性差異(F值分別為479.017，713.766，520.341，均為P<

12、0.001)，用One-wayANOVA和LSD法統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，3個(gè)月時(shí)A組比B組顯著性增加(P<0.001)，且兩者都多于C組(P<0.001)：6個(gè)月和12個(gè)月時(shí)，A組和B組的量顯著比C組多(P<0.001)，但A、B組無顯著性差異(6個(gè)月時(shí)P=0.292，12個(gè)月時(shí)P=0.224)。且各時(shí)間點(diǎn)的分布部位無明顯差異，在灶狀骨髓的血管周圍表達(dá)最多，早期在新生骨質(zhì)邊緣及骨膜處有少量表達(dá)，后期雖有所增加但還是少于前者。 第二部分帶血

13、管蒂筋膜瓣包裹組織工程骨修復(fù)兔橈骨缺損對CGRP和NPY表達(dá)影響的比較 1.CGRP免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果對植入物區(qū)新生骨組織內(nèi)的CGRP的IOD值行3×3析因設(shè)計(jì)方差分析顯示，隨著時(shí)間的增加，各組新生骨組織內(nèi)的CGRP的表達(dá)量都有不同程度的增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為1341.065，1543.547，1339.290，均為P.<0.001)：而在同一時(shí)間點(diǎn)三組之間也存在有顯著性差異(F值分別為85.051，55.718，

14、51.438，均為P<0.001)，用One-wayANOVA和LSD法統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，3個(gè)月時(shí)A組比B、C組顯著增加(P<0.001.)，但C組多與B組(P<0.001)；6個(gè)月和12個(gè)月時(shí)，B組和C組的量顯著少于A組(P<0.001)，但此時(shí)B組卻顯著多于C組(P<0.001)。3個(gè)月時(shí)，A、C兩組CGRP表達(dá)位置大致相同，多在血管和骨髓處，新生骨邊緣和骨膜處也有少量陽性表達(dá)，但B組只在灶狀骨髓周圍發(fā)現(xiàn)有少量表達(dá)。隨著時(shí)間增加，三組在血

15、管周圍、骨髓內(nèi)、骨膜上的表達(dá)量也增加，但6個(gè)月和12個(gè)月時(shí)，CGRP的分布位置以骨膜處和血管周圍最多。 2.NPY免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果對植入物區(qū)新生骨組織內(nèi)的NPY的IOD值(表2-2)行3×3析因設(shè)計(jì)方差分析顯示，隨著時(shí)間的增加，各組新生骨組織內(nèi)的NPY的表達(dá)量都有不同程度的增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為1458.519，1749.496，620.932，均為P<0.001)；而在同一時(shí)間點(diǎn)三組之間也存在有顯著性差異(F值

16、分別為181.460，286.025，286.202，均為P<0.001)，用One-wayANOVA和LSD法統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，3個(gè)月時(shí)A組比B、C組顯著性增加(P<0.001)，但C組多與B組(P<0.001)；6個(gè)月和12個(gè)月時(shí)，C組和B組的量顯著少于A組(P<0.001)，但此時(shí)B組卻顯著性多于C組(P<0.001)。且各時(shí)間點(diǎn)的分布部位無明顯差異，在灶狀骨髓的血管周圍表達(dá)最多，早期在新生骨質(zhì)邊緣及骨膜處有少量表達(dá)，后期雖然有所增加但

17、還是少于前者。 結(jié)論： 1.與神經(jīng)束植入的組織工程骨一樣，植入血管束的組織工程骨和采用筋膜瓣包裹的組織工程骨中均能檢測到神經(jīng)肽CGRP、NPY，表明單純的血管束植入和采用筋膜瓣包裹對重建組織工程骨的感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)有一定作用。 2.植入血管束的組織工程骨和采用筋膜瓣包裹的組織工程骨中CGRP、NPY的表達(dá)量隨著時(shí)間推移而增多，推測兩種促血管化方法都能促進(jìn)相關(guān)神經(jīng)再長。 3.相對于感覺神經(jīng)束植入和單純材料