小兒骨堿性磷酸酶單克隆抗體及免疫層析試紙條的制備.pdf

1、骨堿性磷酸酶（Bone alkaline phosphatase,BAP）是一種骨代謝生化標志物。小兒骨堿性磷酸酶（Neonatal bone alkaline phosphatase,NBAP）含量的檢測常被用來診斷、評估和篩查小兒佝僂病。高親和性和高特異性的抗NBAP單克隆抗體對于建立NBAP的免疫學檢測方法具有重要意義。
　　本文用NBAP作為免疫原免疫小鼠，從二免開始利用間接酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked im

2、munosorbent assay，ELISA）連續(xù)監(jiān)控小鼠血清的效價，五免后，小鼠血清的有效稀釋倍數(shù)高達1,024,000倍。取小鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞（SP2/0）進行細胞融合，融合細胞群經(jīng)HAT培養(yǎng)基篩選、ELISA篩選、細胞克隆等一系列過程后篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗NBAP單克隆抗體的細胞株73株。從中選擇細胞株制備腹水，共得到35種抗NBAP單克隆抗體腹水。將35種腹水用辛酸-硫酸銨法純化，并用紫外分光光度法測定純化后抗體的濃

3、度?？贵w的效價用間接ELISA法測定，結(jié)果表明幾乎所有抗體的效價都大于10,000。細胞上清液、腹水和純化后抗體的比較結(jié)果表明，在所選的38株細胞中，大多數(shù)細胞株具有良好的存活性能及遺傳穩(wěn)定性，能夠產(chǎn)生腹水并穩(wěn)定分泌出單克隆抗體。研究所得到的多株高親和性的抗NBAP抗體，在NBAP的免疫學快速檢測方法中有較好的應(yīng)用前景。
　　研究進一步選取所純化的11種單抗利用雙抗夾心原理在試紙條上相互配對。挑選出配對結(jié)果較好的3株抗NBAP單克

4、隆抗體（3-19-C8、3-12-B6和1-16-B2）用于NBAP膠體金免疫層析試紙條的制備。單抗3-12-B6和1-16-B2分別與膠體金標記，單抗（3-19-C8或者3-12-B6）和羊抗鼠IgG分別噴在硝酸纖維素膜（NC膜）上作為檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線），分別建立了PBS緩沖液體系和人工血清體系中快速檢測NBAP的膠體金免疫層析試紙條方法。NBAP膠體金試紙條的最佳實驗條件如下：單抗3-12-B6和1-16-B2的最佳標記

5、pH均為6；最佳標記量均為5μg/mL；金標抗體的噴量均為7μL/cm；單抗3-19-C8和3-12-B6在T線上的濃度均為2.0 mg/mL；單抗3-19-C8和3-12-B6、3-12-B6和1-16-B2所制備的試紙條的檢測時間分別為15 min和10 min。在最佳實驗條件下，NBAP最低檢測限為：3-19-C8和3-12-B6、3-12-B6和1-16-B2所制備的試紙條在PBS
　　緩沖液體系中分別為5 pg/mL和1

6、0 pg/mL；在人工血清體系中分別為5 pg/mL和25 pg/mL。選取檢測限更低的試紙條進行特異性實驗和加標回收實驗，特異性實驗結(jié)果表明試紙條與成人骨堿性磷酸酶和腸堿性磷酸酶有較低的交叉率，與胎盤堿性磷酸酶無交叉反應(yīng)，這一結(jié)果同時提示小兒和成人體內(nèi)的BAP抗原表位可能存在一定差異。加標回收實驗結(jié)果顯示批內(nèi)回收率為96.2％~108.6%；批間回收率為94.2%~101.0%，批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于15%。綜上表明本文所建立的方