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1、目的:
腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,大約占所有原發(fā)性腦腫瘤的45%,這也是癌癥患者死亡的主要原因之一。盡管標(biāo)準(zhǔn)治療方案包括手術(shù)完整切除、聯(lián)合放化療,但無進(jìn)展生存期仍然很低,新診斷為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者的中位生存期只有12-15個(gè)月。新型烷化劑-替莫唑胺(temozolomide,TMZ)已經(jīng)確定為臨床標(biāo)準(zhǔn)的化療藥物,但是在治療過程中發(fā)現(xiàn)部分患者對(duì)化療并不敏感,所以這種現(xiàn)象嚴(yán)重阻礙了惡性膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。限制替莫唑胺的療效
2、大部分是由于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi) O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine DNA-methyltransferase,MGMT)的活性造成的,它是一種DNA修復(fù)酶主要能夠特定的移除O6-甲基鳥嘌呤上的甲基團(tuán)從而逆轉(zhuǎn)替莫唑胺的療效。近期少數(shù)研究證據(jù)表明,在惡性膠質(zhì)瘤類干細(xì)胞,垂體腺瘤細(xì)胞和U251細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor1α,HIF-1α)可以下調(diào)MGMT的
3、表達(dá)。HIF-1α在腫瘤血管生成、進(jìn)展、復(fù)發(fā)和化療耐藥等方面扮演著重要的作用,其中也包括腦膠質(zhì)瘤。本實(shí)驗(yàn)采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),以人源性惡性膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞株為研究對(duì)象,觀察HIF-1α靶向抑制劑FM19G11是否影響替莫唑胺對(duì)惡性膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞株的細(xì)胞增殖抑制作用和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用,同時(shí)進(jìn)一步探索它們之間的分子調(diào)控機(jī)制。
方法:
以人源性惡性膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞株為研究對(duì)象,T98G細(xì)胞培養(yǎng)于37℃恒溫缺氧培養(yǎng)箱
4、中,氣體條件為5%CO2,1%O2,94%N2。設(shè)置實(shí)驗(yàn)對(duì)照組,使用不同濃度的HIF-1α靶向抑制劑FM19G11和替莫唑胺分別單獨(dú)處理以及二者的聯(lián)合處理T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞,采用CCK-8法和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)上述不同藥物處理后T98G細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制作用;采用hochest33258染色法和流式細(xì)胞技術(shù)分別測(cè)定在不同處理?xiàng)l件下T98G細(xì)胞的凋亡作用;采用qPCR法檢測(cè)在不同處理?xiàng)l件下T98G細(xì)胞內(nèi)HIF-1α及其下游靶基因的m
5、RNA表達(dá)量的差異;采用Western blot法檢測(cè)在不同處理?xiàng)l件下T98G細(xì)胞內(nèi)HIF-1α及其下游靶基因,以及MGMT和NF-κB信號(hào)通路中P65蛋白表達(dá)水平的差異;采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)T98G細(xì)胞中MGMT和NF-κB信號(hào)通路中P65蛋白表達(dá)水平的差異。
結(jié)果:
?、臡GMT蛋白在各惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中呈差異性表達(dá),篩選出MGMT高表達(dá)的細(xì)胞株。通過Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MGMT蛋白在惡性膠質(zhì)
6、瘤T98G細(xì)胞中呈陽性表達(dá),而在U251,U87MG和U373細(xì)胞中MGMT表達(dá)均非常低或幾乎不表達(dá)。故選擇惡性膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞株作為接下來的實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。⑵FM19G11和替莫唑胺各自單獨(dú)處理以及二者聯(lián)合處理惡性膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞后,通過CCK-8法和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)顯示FM19G11單獨(dú)處理對(duì)T98G細(xì)胞無增殖抑制作用,而替莫唑胺對(duì)T98G細(xì)胞的具有增殖抑制作用,但并不敏感;與替莫唑胺單獨(dú)處理相比,F(xiàn)M19G11和替莫唑胺
7、的聯(lián)合處理對(duì)惡性膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞具有顯著地增殖抑制作用(P<0.05)。⑶通過顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與hoechst33258染色法觀察發(fā)現(xiàn), FM19G11單獨(dú)處理并不誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞發(fā)生凋亡性形態(tài)改變,替莫唑胺單獨(dú)處理能夠使瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡性形態(tài)改變,而二者的聯(lián)合作用對(duì)T98G細(xì)胞的凋亡形態(tài)改變的程度較替莫唑胺單獨(dú)處理更加明顯。⑷通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn),F(xiàn)M19G11單獨(dú)處理并不誘導(dǎo)T98G細(xì)胞發(fā)生凋亡,替莫唑胺單
8、獨(dú)處理能夠誘導(dǎo)T98G細(xì)胞發(fā)生凋亡作用,而二者的聯(lián)合處理對(duì)T98G細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)能力更強(qiáng)(P<0.05)。⑸FM19G11作用后靶向抑制T98G細(xì)胞內(nèi)HIF-1α及其下游靶基因的表達(dá)水平。通過qPCR法和Western blot法結(jié)果顯示,在不同濃度的FM19G11處理下T98G細(xì)胞內(nèi)HIF-1α,VEGF和EPO的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05),而且具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。⑹NF-κB信號(hào)通路可能參與FM19
9、G11抑制惡性膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞內(nèi)MGMT的表達(dá)水平。通過Western blot法實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在不同濃度FM19G11處理后MGMT和NF-κB P65蛋白表達(dá)均明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05),而且具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。⑺通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)惡性膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞內(nèi)MGMT和NF-κB P65的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同濃度FM19G11處理后瘤細(xì)胞內(nèi)MGMT和NF-κB P65蛋白的熒光強(qiáng)度顯著低于正常對(duì)照組(P<0
10、.05),而且具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。這進(jìn)一步證明NF-κB信號(hào)通路可能參與FM19G11抑制惡性膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞內(nèi)MGMT的表達(dá)水平。⑻通過Western blot法檢測(cè)在FM19G11(2.0μM)和替莫唑胺(500μM)分別單獨(dú)處理及二者聯(lián)合處理后,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與正常對(duì)照組相比,F(xiàn)M19G11單獨(dú)處理能夠顯著下降T98G細(xì)胞內(nèi)MGMT蛋白的表達(dá)水平(P<0.05),而替莫唑胺能夠上調(diào)T98G細(xì)胞內(nèi)MGMT蛋白的表達(dá)(P<0.0
11、5);而FM19G11和替莫唑胺的聯(lián)合處理能顯著降低瘤細(xì)胞內(nèi)MGMT蛋白的表達(dá)(P<0.05)。最重要的是,我們觀察到FM19G11單獨(dú)處理不但能明顯下調(diào)NF-κB信號(hào)通路P65亞基的表達(dá)水平(P<0.05),在它與替莫唑胺聯(lián)合作用之后,這種下調(diào)作用仍然十分顯著(P<0.05)。
結(jié)論:
FM19G11主要通過靶向抑制HIF-1α的表達(dá),進(jìn)而下調(diào)MGMT蛋白的表達(dá),從而增加惡性膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的藥物敏感性
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