EZH2參與調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤對替莫唑胺化療敏感性的機理研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最為常見的原發(fā)性腦腫瘤，約2/3為惡性膠質(zhì)瘤。盡管目前常規(guī)手術、放療和化療等綜合措施取得了長足進步，但膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)的2年生存率仍不到30％。臨床上常出現(xiàn)相同級別和相同治療方案的腦膠質(zhì)瘤患者存在明顯預后不同的現(xiàn)象，究其原因可能與腫瘤內(nèi)在的生物特性以及對化療的敏感性密切相關。近年來腦膠質(zhì)瘤的化療逐步得到重視，TMZ已成為輔助化療中的一線藥物，因此影響化療敏感性以及探討其機理也成為臨床神經(jīng)外科十分關注的課題之一。

2、>　　果蠅zeste基因增強子同源物2即EZH2作為PRC2的催化亞基，它可以在組蛋白3上的27位賴氨酸上添加3個甲基基團。這種3甲基化后的組蛋白可以導致染色質(zhì)凝集和很多與腫瘤增殖、侵襲性以及血管生成等方面有關的癌基因或抑癌基因在表觀遺傳學上的激活或沉默。
　　本研究擬體外在U87、U251、T98三個膠質(zhì)母細胞瘤細胞株中分析EZH2的表達差異，構建EZH2慢病毒干擾的GBM轉(zhuǎn)染株，建立EZH2表達量不同的GBM細胞株，然后檢測其

3、對替莫唑胺的敏感性的變化，同時進一步測定EZH2的表達水平與DNA損傷修復蛋白表達量的關系，并通過抑制DNA損傷修復通路中的關鍵蛋白來檢測GBM對替莫唑胺的敏感性變化，從而探討DNA損傷修復途徑在EZH2調(diào)控GBM對化療耐藥中的作用。實驗分為兩部分:第一部分，研究EZH2表達水平與GBM對TMZ化療敏感性的關系;第二部分，DNA修復在EZH2調(diào)控GBM對TMZ敏感性中的作用
　　第一部分 EZH2表達水平與GBM對TMZ化療敏感性

4、強弱的關系
　　目的:研究EZH2與膠質(zhì)瘤化療敏感性之間的關系，驗證EZH2敲減后的GBM細胞株對TMZ化療敏感性的變化。
　　方法:分別應用Real-time PCR和Westem-blot方法檢測EZH2在U87、U251、T98中的mRNA和蛋白表達水平，并應用CCK-8法檢測U87、U251、T98對TMZ的IC50值的不同。構建EZH2干擾的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染GBM細胞株，用流式細胞學鑒定轉(zhuǎn)染率，RT-PCR和Wes

5、tern-blot方法鑒定EZH2的mRNA和蛋白的敲減效率，并用CCK-8法檢測敲減EZH2后的細胞株對TMZ敏感性的變化。
　　結(jié)果:EZH2的mRNA表達水平依次為U251＞T98＞U87，U251與T98之間未達到統(tǒng)計學差異，U87分別與U251和T98兩兩之間達到統(tǒng)計學差異。EZH2的蛋白表達水平與其mRNA表達水平高低順序基本相同。U251、T98和U87經(jīng)替莫唑胺處理后測得其IC50值依次降低，U251與T98之間無

6、明顯差異，U87與U251之間有顯著差異，U87與T98之間有顯著差異。慢病毒轉(zhuǎn)染細胞U87、U251細胞株后的轉(zhuǎn)染率經(jīng)流式細胞術測得均達99％以上，其相應的EZH2蛋白敲減效率分別達95％和50％。在U87、U251中，敲減EZH2的細胞株對TMZ的IC50值相較于未敲減株明顯降低。
　　結(jié)論:EZH2的高表達使GBM細胞對替莫唑胺的敏感性減弱，敲減EZH2后，U87和U251細胞對TMZ的敏感性均明顯增強。
　　第二部分

7、 DNA修復途徑在EZH2調(diào)控的GBM對TMZ敏感性中的作用
　　目的:研究EZH2基因敲減后的DNA修復水平變化及與GBM對TMZ敏感性變化的關系。
　　方法:建立EZH2敲減的U87、U251細胞株，通過western-blot檢測其MGMT、MSH2、MSH6、XRCC1、PARP1蛋白表達水平的變化，并通過抑制PARP1后用CCK-8法檢測U87、U251(si-EZH2)細胞株對TMZ的IC50值變化。
　　

8、結(jié)果:敲減EZH2的U87細胞株的XRCC1、MSH2、MSH6、PARP1蛋白表達水平較未敲減組明顯降低。而敲減EZH2的U251細胞株MGMT、PARP1蛋白表達水平較未敲減組明顯降低。U87和U251細胞株的si-EZH2+PARP1 i組的IC50值均較si-EZH2組明顯降低，PARP1 i組較正常對照組IC50值明顯降低，但其與si-EZH2組比較未見明顯變化。經(jīng)TMZ誘導后U87、U251的PARP1蛋白水平隨著加藥時間的

9、延長有所上升且未敲減EZH2組的PARP1蛋白水平較敲減組上升的更為明顯。
　　研究結(jié)果說明:DNA修復蛋白PARP1受抑制后，U87、U251細胞對TMZ的敏感性明顯增加;同時敲減EZH2和抑制PARP1后的U87、U251對TMZ敏感性增加最明顯，且隨著TMZ誘導時間的延長，未敲減組的PARP1蛋白水平較敲減組有明顯的增加。
　　結(jié)論:EZH2蛋白表達水平可影響相關DNA修復蛋白表達水平，提示EZH2基因可能參與了DNA