GEF-H1在抗結核免疫應答中的功能研究.pdf

1、結核病(tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的、對人類公共健康危害最大的傳染病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)統(tǒng)計，2015年新發(fā)結核病例1040萬，其中48萬為多重耐藥結核，10萬人為利福平耐藥結核;結核致死人數(shù)高達140萬，約19萬人死于多重耐藥結核。由此可見，結核病對人類的生命健康威脅仍然十分嚴峻，

2、是亟待解決的全球性公共衛(wèi)生問題?？股亻L期使用以及抗結核藥物使用的不合理，導致耐多藥結核菌株的產(chǎn)生和傳播;結核-HIV的聯(lián)合感染，使結核病的治療變得更加復雜和困難。深入研究MTB致病機制、免疫病理及免疫系統(tǒng)殺傷和清除MTB的機制，對尋找有效的抗結核治療和預防的新靶點，具有非常重要的意義。機體的免疫系統(tǒng)防御反應在抵抗MTB感染中發(fā)揮著至關重要的作用。MTB被肺泡和間質巨噬細胞、以及局部樹突狀細胞(dendritic cell，DC)識別時

3、，引發(fā)先天免疫應答。巨噬細胞(macrophage，Mψ)是機體抗結核感染的第一道防線，通過表達Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)、免疫球蛋白受體、補體受體和凝集素受體等多種模式識別受體(pattern recognition receptors，PRR)，與入侵的MTB相關抗原結合，從而介導MTB的粘附及吞噬，發(fā)揮胞內殺菌效應。
　　Ras同源家族的小鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(The Rho family

4、 of smallGTP-binding proteins，Rho-GTPases)作為基本細胞活動的分子開關，通過結合GTP或GDP而發(fā)生活性與非活性狀態(tài)的改變，在肌動蛋白細胞骨架重組、細胞遷移和粘附、活性氧形成和細胞凋亡中等多種細胞生命過程中發(fā)揮著至關重要的調控作用。鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)家族成員促進GTP與GDP交換，是確保Rho-GTPases在特定空

5、間和時間激活的理想分子。在GEF家族中，鳥嘌呤核苷酸交換因子H1(GEF-H1)活性受微管結合的調節(jié)，從而參與細胞形變、p53腫瘤抑制基因的突變、細胞周期等生理生化過程。研究表明，GEF-H1的表達缺失或上調可調節(jié)細胞信號轉導、Rho家族成員之一RhoA活性及抗感染免疫反應。然而，目前尚未見到GEF-H1調控被感染Mψ抵抗MTB感染的相關報道。
　　本課題探究了MTB感染Mψ后GEF-H1的表達變化及調節(jié)機制，并探討了GEF-H1

6、通過調控p38MAPK、TBK1通路，調節(jié)MTB感染Mψ中促炎因子表達，最終影響Mψ抑菌活性的機制，為進一步研究GEF-H1在Mψ抗結核感染免疫中的作用機制奠定了基礎，為開發(fā)通過GEF-H1調控Mψ抑菌活性的抗結核藥物提供了潛在靶點，對結核的有效防控具有重要意義。
　　目的:
　　1.確定GEF-H1與MTB感染的相關性，闡明MTB感染如何誘導GEF-H1表達;
　　2.揭示GEF-H1對Mψ清除MTB的調控作用;

7、r>　　方法:
　　1.檢測MTB感染后GEF-H1的表達水平
　　a.采用采用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測MTB感染Mψ中GEF-H1的mRNA表達水平;
　　b.采用Western blot，檢測MTB感染Mψ中GEF-H1的蛋白表達水平。
　　2.研究MTB感染誘導GEF-H1表達增加的機制
　　a.采用多種信號通路抑制劑預處理Mψ后，Real-time PCR檢測Mψ中GEF

8、-H1的mRNA表達水平;
　　b.免疫熒光-激光掃描共聚焦顯微鏡觀察MTB感染Mψ中，GEF-H1與微管的共定位。
　　3.探討調節(jié)Mψ炎癥反應及抑菌效應的分子機制
　　a.采用siRNA沉默Mψ中GEF-H1的表達;
　　b.通過平板菌落計數(shù)(CFU)實驗，檢測沉默GEF-H1后MTB感染Mψ的抑菌活性;
　　c.采用流式細胞術檢測Mψ吞噬Texas-Red標記BCG的能力;
　　d.Griess

9、法和Western blot檢測沉默GEF-H1后MTB感染Mψ的NO產(chǎn)生和自噬發(fā)生情況;
　　e.用Real-time PCR和ELISA檢測GEF-H1表達沉默對MTB感染Mψ促炎因子表達的調節(jié)效應;
　　f.Western blot檢測沉默GEF-H1后MTB感染Mψ的p38MAPK、TBK1通路活化;
　　g.G-LISA檢測沉默GEF-H1后MTB感染Mψ的RhoA活性。
　　結果:
　　1.MT

10、B感染Mψ細胞系后，GEF-H1的表達水平顯著上調，并呈時間及感染劑量依賴性。
　　2.MTB感染誘導的GEF-H1高表達依賴于p38、ERK、JNK及NF-κB信號通路，同時與MTB感染后微管的解聚有關。
　　3.MTB感染Mψ后，GEF-H1促進Mψ吞噬及清除胞內MTB。
　　4.MTB感染Mψ后，GEF-H1通過激活p38MAPK和TBK1信號通路促進Mψ表達與分泌促炎細胞因子IL-6、IL-1β，從而發(fā)揮抑菌活