殼寡糖組裝結核黏膜基因疫苗誘導抗結核黏膜免疫及其免疫保護作用.pdf

1、結核病(tuberculosis，TB)是由人型結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的以肺部慢性肉芽腫炎癥病變?yōu)橹鞯穆詡魅静?。雖然卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)的全球接種曾一度較好地控制了結核病，然而，由于多重/廣泛耐藥結核菌株的出現(xiàn)、結核一線藥物的失效、卡介苗在控制成人肺結核方面的逐步失效和艾滋病的合并感染，結核病已在全球死灰復燃。MTB目前已感染全

2、球三分之一人口，2008年新增結核病例高達940萬，死亡病例170萬。在我國，目前近半數(shù)人口感染MTB，年新增病例150萬，死亡病例13萬。結核病已一躍成為我國傳染性疾病的首位，成為制約我國社會經(jīng)濟發(fā)展的重要因素。作為目前唯一獲準用于預防結核病的BCG，卻僅能預防兒童結核病和肺外結核，無法預防成人肺結核。如無有效的預防控制措施，在未來10年內我國可能出現(xiàn)3000萬新增結核病患者，形勢嚴峻。因此，制備新型的可有效預防結核桿菌感染的疫苗及策

3、略是控制結核病的當務之急。目前，廣泛認為以分泌IFN-γ的CD4+Th1細胞為特征的Th1型免疫應答在抗結核感染中發(fā)揮重要保護作用。為誘導多特異性Th1型細胞免疫，我所前期研究結核優(yōu)勢抗原Ag85A、Ag85B、ESAT-6和CFP10抗原，預測獲得四個T細胞表位多肽，將其插入結核桿菌熱休克蛋白HSP65的非關鍵結構域中，再構建于真核質粒pcDNA3.1，獲得以HSP65為基因載體的含四個表位的多表位基因疫苗pHSP65pep，該疫苗經(jīng)

4、肌肉注射免疫可誘導特異性脾臟IFN-γ+Th1細胞免疫和HSP65特異性血清IgG，具有一定的抗結核免疫保護作用(Vaccine 2009;27:5313-19; Microbil Immunol.2009; 53(10):541-9)。然而，該疫苗還存在兩個不足之處，首先，我們觀察到免疫三個月后部分小鼠出現(xiàn)膝關節(jié)腫脹的自身免疫病癥狀，與少數(shù)報道相符，其原因與結核HSP65蛋白與哺乳動物關節(jié)軟骨糖蛋白具有交叉抗原成分有關。因此有必要對基

5、因疫苗的載體HSP65進行適當改造，使誘導自身免疫的危險降低。點突變與缺失改造的主要靶序列確定為HSP65蛋白的第180-188aa基序。其次，該疫苗僅能誘導全身性(systemic immunity)免疫應答，而不能誘導黏膜免疫(mucosal immunity)。新近研究提示:結核特異性Th1細胞在肺黏膜的募集和激活才是疫苗保護的關鍵。滴鼻免疫是誘導肺黏膜免疫的最佳免疫方式，但黏膜微環(huán)境容易降解抗原，因此選擇優(yōu)良的黏膜遞送介質是誘導

6、肺黏膜免疫的關鍵。來源于幾丁質(chitin)的天然生物多糖殼聚糖(chitosan)及其寡聚體—殼寡糖（chitosan oligosaccharides，COS）系陽離子多聚物，因其無毒、緩釋、促進黏膜吸附吸收等特性，成為黏膜遞送載體的良好候選。Chitosan和COS與DNA共聚可形成納米級均一復合物顆粒，不僅有助于黏膜緩釋，還利于黏膜M細胞的攝取從而增強抗原提呈。特別是COS，具有水溶性、低粘度和低分子量特性，更有助于制備多糖-

7、DNA多聚復合物。因此我們采用chitosan（殼聚糖）、COS（殼寡糖）與上述經(jīng)改造的多表位基因疫苗共聚形成結核黏膜基因疫苗，經(jīng)滴鼻免疫，以誘導的肺淋巴細胞中IFN-γ+T細胞比例和肺灌洗液SIgA水平來評價其黏膜免疫效果;以脾淋巴細胞中IFN-γ+T細胞比例和血清IgG抗體效價評價其全身免疫效果;然后以大劑量BCG攻毒評價免疫保護效果。探討肺黏膜免疫的誘導在抗結核免疫保護中的意義。進一步，我們采用BCG初免-結核黏膜基因疫苗滴鼻加強

8、免疫的策略，再次證實結核黏膜基因疫苗配合全民已接種的BCG免疫后的免疫保護效果。獲得以下主要結果:一、結核多表位基因疫苗載體(HSP65)的改造及其免疫學特性研究1)根據(jù)文獻提示:HSP65蛋白第180-188aa中含有自身免疫原性相關表位。于是對第二位的苯丙氨酸(Phe)、笫五位的谷氨酰胺(Gln)和第八位的亮氨酸(Leu)分別予以點突變;同時對180-188aa整段缺失。針對pHSP65和pHSP65pep，分別得到4種突變質粒，m

9、utant-1(第二位Phe突變Ala)、mutant-2(第五位Gln突變Ala)、mutant-3(第八位Leu突變Ala)及mutant-4（整段缺失）。2)將上述不同載體改造的質粒，以未改造的pHSP65pep、pHSP65質粒為對照，分別于0、2、4、6周肌肉注射免疫雌性BALB/c小鼠，每次50μg/只，每組10只小鼠，共4次。3)檢測所改造質粒的結核特異性免疫原性，發(fā)現(xiàn):與未經(jīng)改造的pHSP65pep結核基因疫苗相比，mu

10、tant-3和4誘導的結核特異性IFN-γ+CD4+Th1細胞免疫應答均無顯著降低;而mutant-1和2誘導的T細胞應答低于未改造基因疫苗。提示:對載體HSP65蛋白第180-188aa的mutant-3和4的改造，不會影響HSP65載體的免疫原性及所含表位的免疫原性。4)檢測各改造質粒免疫小鼠可能誘導的自身免疫應答和病理，發(fā)現(xiàn):免疫3個月后，未經(jīng)改造的pHSP65質粒免疫的部分小鼠膝關節(jié)出現(xiàn)輕度紅腫，血清抗dsDNA抗體有所升高，腎

11、臟和關節(jié)病理HE染色及免疫復合物沉積試驗發(fā)現(xiàn):原始pHSP65質粒具有誘導輕微腎小球腎炎潛能;而各改造質粒均未出現(xiàn)大體和病理異常，特別是mutant-4質粒，與正常小鼠的腎臟、關節(jié)組織病理無異。提示:對于載體HSP65蛋白第180-188aa的點突變或缺失改造，使以該載體為基礎的結核基因疫苗誘導自身免疫應答的潛能降至最低，而其誘導結核特異性Th1免疫的能力不變，因此得到顯著改良。5)綜合結核特異性免疫和自身免疫結果，選擇HSP65蛋白第

12、180-188aa完全缺失突變質粒作為后續(xù)實驗中多表位結核黏膜基因疫苗，為簡潔，仍使用pHSP65pep字樣代表。6)利用PET-32a(+)系統(tǒng)，體外表達并純化得到大量HSP65蛋白。經(jīng)Western Blot鑒定為有活性的HSP65蛋白。二、殼寡糖組裝結核黏膜基因疫苗的理化性質及其免疫原性和抗結核免疫保護特性研究為了誘導結核特異性黏膜免疫，采用兩種來源于幾丁質的天然生物多糖，殼聚糖(chitosan)和殼寡糖(COS)，分別與質粒D

13、NA通過共凝聚法制備了chi-DNA和COS-DNA復合物顆粒疫苗。研究了其理化特性以及在小鼠體內的免疫原性和免疫保護特性。1)以0.02％的chitosan溶液在酸性條件、0.4％的COS溶液在中性條件，分別與質粒DNA復合形成chitosan-DNA(簡稱chi-DNA)和COS-DNA復合物顆粒。經(jīng)掃描電鏡和動態(tài)光散射證實為大小均一的球形顆粒，前者顆粒直徑約200-400hm，后者直徑約300-500nm。2)以瓊脂糖凝膠電泳實驗

14、檢測兩種多糖對DNA的保護效果，發(fā)現(xiàn)DNA與殼聚糖或殼寡糖形成緊密大分子復合物,無法在電場中泳動而留在加樣孔中。以高濃度DNase Ⅰ消化裸露質粒DNA很快被降解;而chi-DNA、COS-DNA中的DNA仍完好無損;如先以高濃度的chitosanase酶解多糖，使DNA被釋放，再加入DNase Ⅰ，DNA可被降解。提示chitosan和COS均能保護DNA免受酶解。3)體外，以pGL3-Control熒光質粒為報告基因，以chi-DN

15、A、COS-DNA、DNA分別轉染293T細胞，檢測熒光表達強度，發(fā)現(xiàn):與裸露質粒DNA相比，兩種黏膜介質均可顯著促進報告基因的細胞表達，COS效果好于chitosan。4)以chi-DNA、COS-DNA結核黏膜基因疫苗與裸露DNA疫苗分別于0、2、4、6周滴鼻免疫BALB/c小鼠，每次50μg，共4次，BCG皮下注射為對照。5)與裸露基因疫苗相比，黏膜基因疫苗滴鼻免疫誘導了相當水平的全身性免疫，即高水平血清IgG和脾臟Th1免疫。在

16、血清IgG方面，COS-DNA和chi-DNA均誘導了較高水平的血清IgG，效價分別為15000和12000，與裸露結核基因疫苗誘導的IgG效價類似(12000)，但低于BCG (320000)，其誘導的IgG類別均為IgG2a。在脾臟Th1細胞應答的誘導方面，COS-pHSP65pep與chi-pHSP65pep誘導的Th1細胞比例分別為2.88％和2.53％，顯著高于裸露質粒DNA的1.22％和BCG組的0.85％。提示黏膜基因疫苗

17、仍舊可誘導良好的全身性免疫應答。6)黏膜免疫應答的誘導主要表現(xiàn)為肺灌洗液SIgA和肺內Th1型免疫應答。在肺灌洗液SIgA方面，僅有天然多糖COS和chitosan組裝的結核基因疫苗誘導了高水平的SIgA，效價分別為1500和1000;裸露質粒組誘導的SIgA效價低于200。而與chitosan相比，COS更為顯著地促進了HSP65特異性SIgA抗體親和力成熟。提示黏膜遞送系統(tǒng)組裝基因疫苗才能使其具有誘導特異性黏膜抗體的能力，且殼寡糖(

18、COS)具有比殼聚糖(chitosan)更好的誘導SIgA能力。7)在誘導肺黏膜特異性T細胞免疫應答方面，即肺黏膜IFN-γ+Th1和CTL應答方面，首先，胞內染色結果發(fā)現(xiàn):COS-pHSP65pep誘導的肺臟Th1和CTL細胞比值為4.53％和7.25％，顯著高于裸露DNA組的1.75％ (Th1)、2.68％ (CTL)和BCG組的2.05％ (Th1)、3.41％ (CTL)，略高于chi-pHSP65pep的3.87％ (Th1

19、)和5.13％(CTL)。其次，ELISPOT結果顯示:與DNA和BCG組相比，COS-DNA和chi-DNA顯著增加肺內IFN-γ+Th1細胞數(shù)量，分別為220/120 SFC/106細胞，相比COS-DNA效果更為顯著。提示滴鼻給予COS-DNA最為顯著地促進了全身及黏膜部位Th1型免疫應答的產(chǎn)生。8)經(jīng)大劑量BCG攻毒后4周，檢測結核黏膜基因疫苗的免疫保護效果。發(fā)現(xiàn):①不免疫小鼠攻毒后產(chǎn)生了嚴重的肺部炎癥灶和組織損傷，提示肺結核的

20、產(chǎn)生。②各免疫組相比，裸露結核基因疫苗滴鼻免疫的保護效果有限，肺臟中可見明顯炎性病灶，肺泡結構有擴張性改變;而經(jīng)COS和chitosan遞送的黏膜基因疫苗的免疫保護顯著增強，特別是COS-pHSP65pep組，僅發(fā)現(xiàn)極小炎癥灶和肺泡上皮組織增厚。③肺臟和脾臟菌落計數(shù)提示:對照組的脾、肺結核桿菌數(shù)達到105CFU;裸露結核基因疫苗免疫組小鼠的肺臟和脾臟中，仍有103數(shù)量級的結核桿菌;chitosan組裝結核基因疫苗組臟器細菌數(shù)降至101數(shù)

21、量級;而經(jīng)COS組裝結核基因疫苗組臟器細菌數(shù)降至幾乎檢測不到。提示黏膜結核多表位基因疫苗滴鼻免疫可使肺、脾臟的結核桿菌數(shù)量降低4個數(shù)量級。免疫病理和菌落計數(shù)結果強烈提示:結核多表位基因疫苗pHSP65pep具有一定免疫保護效果;而以COS黏膜遞送系統(tǒng)進行黏膜遞送后，因顯著增強了肺黏膜免疫T細胞和抗體應答，從而顯著增強了抗結核免疫保護效果。三、BCG初免-殼寡糖組裝結核黏膜基因疫苗加強免疫策略的抗結核保護研究基于我國普遍計劃接種BCG的事

22、實，在應用方面，研究BCG初免(prime)-黏膜基因疫苗加強(boost)免疫策略將更具有現(xiàn)實意義。1) BALB/c小鼠0周時行皮下初次免疫1×104CFU BCG，再以chi-DNA、COS-DNA復合物顆粒和裸露DNA疫苗分別于2、4、6周滴鼻加強免疫3次，每次質粒50μg，1×104 CFU BCG皮下注射4次組作為陽性對照。2)在血清IgG水平方面:與前次免疫相比，BCG初免-結核黏膜基因疫苗加強策略顯著增強了HSP65特異

23、性血清IgG水平，效價均有顯著提高，COS-DNA組和chitosan-DNA組分別誘導了效價達120000的IgG，高于裸露質粒DNA加強免疫誘導的IgG (50000)。IgG亞類仍以IgG2a為主。3)在全身T細胞應答方面:COS-pHSP65pep組脾臟CD4+IFN-γ+T和CD8+IFN-γ+T細胞比例相對各組最高，為2.15％和1.57％，顯著高于其他各組(p＜0.05)。提示該策略在脾臟中誘導Th1型細胞應答為主，CTL

24、應答不明顯。4)在肺灌洗液SIgA誘導方面:COS-DNA疫苗加強免疫誘導的SIgA效價為1300，顯著高于chitosan-DNA疫苗誘導的700;而裸露DNA疫苗加強免疫未能誘導肺灌洗液SIgA，提示COS在增強黏膜抗體應答方面的優(yōu)勢。5)肺黏膜T細胞應答方面:COS-pHSP65pep組誘導了9.32％的CD4+IFN-γ+Th1，顯著高于裸露基因疫苗和BCG組的6.43％和5.68％ (p＜0.001)，同時，其誘導的肺內CTL

25、細胞比例為9.65％，與chitosan-DNA組結果類似，而顯著高于pHSP65組的6.78％ (p＜0.05)，提示BCG初免后COS仍然能夠顯著增加pHSP65基因疫苗誘導原本難以誘導的肺淋巴細胞Th1和CTL比例。6)經(jīng)BCG攻毒后，發(fā)現(xiàn):經(jīng)COS和chitosan遞送的黏膜基因疫苗的免疫保護顯著增強，特別是COS-pHSP65pep組，僅發(fā)現(xiàn)極小炎癥灶和肺泡上皮組織增厚。菌落計數(shù)提示:對照組的脾、肺結核桿菌數(shù)達到105CFU;

26、chitosan組裝結核基因疫苗組臟器細菌數(shù)降至101數(shù)量級;而COS組裝結核基因疫苗免疫組臟器細菌數(shù)降至100。提示BCG初免-chitosan/COS黏膜結核基因疫苗加強策略，顯著增強了結核基因疫苗的免疫保護功能。本研究在免疫所前期自主構建的結核多表位基因疫苗pHSP65pep的基礎上，在兩方面進行了優(yōu)化。首先，對其具有一定自身免疫原性的載體HSP65載體蛋白進行了缺失突變改造，保留其誘導結核特異性免疫應答能力，但降低了其誘導自身免

27、疫的可能。其次，為更好地誘導肺內黏膜免疫，以早期清除肺內結核分枝桿菌，采用兩種黏膜遞送載體介質:殼聚糖(chitosan)、殼寡糖(COS)與改造后的結核黏膜基因疫苗，組裝成為具有納米顆粒特性的結核黏膜基因疫苗chitosan-pHSP65pep和COS-pHSP65pep。經(jīng)滴鼻免疫，證實上述兩種結核黏膜基因疫苗在保留誘導全身性免疫應答（血清IgG、脾臟T細胞應答）的基礎上，均可顯著增強特異性肺黏膜免疫應答，包括裸露基因疫苗難以誘導的

28、肺灌洗液SIgA，和良好水平的肺淋巴細胞IFN-γ+Th1應答。其中，殼寡糖具有比殼聚糖更為顯著的增強黏膜免疫應答的能力。經(jīng)攻毒評估保護效果發(fā)現(xiàn):兩種結核黏膜基因疫苗均可增強抗結核保護，特別是COS-DNA黏膜基因疫苗，發(fā)揮了最好的免疫保護能力。最后采用BCG初免-黏膜基因疫苗加強策略，進一步證實了結核黏膜基因疫苗增強黏膜免疫和增強抗結核免疫保護效果的作用。我們的研究，以誘導肺黏膜免疫為疫苗研制出發(fā)點，創(chuàng)新性地采用兩種幾丁質來源的天然陽