殼寡糖組裝結(jié)核黏膜基因疫苗誘導(dǎo)抗結(jié)核黏膜免疫及其免疫保護(hù)作用.pdf

1、結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由人型結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的以肺部慢性肉芽腫炎癥病變?yōu)橹鞯穆詡魅静　ｋm然卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)的全球接種曾一度較好地控制了結(jié)核病，然而，由于多重/廣泛耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)、結(jié)核一線(xiàn)藥物的失效、卡介苗在控制成人肺結(jié)核方面的逐步失效和艾滋病的合并感染，結(jié)核病已在全球死灰復(fù)燃。MTB目前已感染全

2、球三分之一人口，2008年新增結(jié)核病例高達(dá)940萬(wàn)，死亡病例170萬(wàn)。在我國(guó)，目前近半數(shù)人口感染MTB，年新增病例150萬(wàn)，死亡病例13萬(wàn)。結(jié)核病已一躍成為我國(guó)傳染性疾病的首位，成為制約我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要因素。作為目前唯一獲準(zhǔn)用于預(yù)防結(jié)核病的BCG，卻僅能預(yù)防兒童結(jié)核病和肺外結(jié)核，無(wú)法預(yù)防成人肺結(jié)核。如無(wú)有效的預(yù)防控制措施，在未來(lái)10年內(nèi)我國(guó)可能出現(xiàn)3000萬(wàn)新增結(jié)核病患者，形勢(shì)嚴(yán)峻。因此，制備新型的可有效預(yù)防結(jié)核桿菌感染的疫苗及策

3、略是控制結(jié)核病的當(dāng)務(wù)之急。目前，廣泛認(rèn)為以分泌IFN-γ的CD4+Th1細(xì)胞為特征的Th1型免疫應(yīng)答在抗結(jié)核感染中發(fā)揮重要保護(hù)作用。為誘導(dǎo)多特異性Th1型細(xì)胞免疫，我所前期研究結(jié)核優(yōu)勢(shì)抗原Ag85A、Ag85B、ESAT-6和CFP10抗原，預(yù)測(cè)獲得四個(gè)T細(xì)胞表位多肽，將其插入結(jié)核桿菌熱休克蛋白HSP65的非關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域中，再構(gòu)建于真核質(zhì)粒pcDNA3.1，獲得以HSP65為基因載體的含四個(gè)表位的多表位基因疫苗pHSP65pep，該疫苗經(jīng)

4、肌肉注射免疫可誘導(dǎo)特異性脾臟IFN-γ+Th1細(xì)胞免疫和HSP65特異性血清IgG，具有一定的抗結(jié)核免疫保護(hù)作用(Vaccine 2009;27:5313-19; Microbil Immunol.2009; 53(10):541-9)。然而，該疫苗還存在兩個(gè)不足之處，首先，我們觀察到免疫三個(gè)月后部分小鼠出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)腫脹的自身免疫病癥狀，與少數(shù)報(bào)道相符，其原因與結(jié)核HSP65蛋白與哺乳動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨糖蛋白具有交叉抗原成分有關(guān)。因此有必要對(duì)基

5、因疫苗的載體HSP65進(jìn)行適當(dāng)改造，使誘導(dǎo)自身免疫的危險(xiǎn)降低。點(diǎn)突變與缺失改造的主要靶序列確定為HSP65蛋白的第180-188aa基序。其次，該疫苗僅能誘導(dǎo)全身性(systemic immunity)免疫應(yīng)答，而不能誘導(dǎo)黏膜免疫(mucosal immunity)。新近研究提示:結(jié)核特異性Th1細(xì)胞在肺黏膜的募集和激活才是疫苗保護(hù)的關(guān)鍵。滴鼻免疫是誘導(dǎo)肺黏膜免疫的最佳免疫方式，但黏膜微環(huán)境容易降解抗原，因此選擇優(yōu)良的黏膜遞送介質(zhì)是誘導(dǎo)

6、肺黏膜免疫的關(guān)鍵。來(lái)源于幾丁質(zhì)(chitin)的天然生物多糖殼聚糖(chitosan)及其寡聚體—?dú)す烟牵╟hitosan oligosaccharides，COS）系陽(yáng)離子多聚物，因其無(wú)毒、緩釋、促進(jìn)黏膜吸附吸收等特性，成為黏膜遞送載體的良好候選。Chitosan和COS與DNA共聚可形成納米級(jí)均一復(fù)合物顆粒，不僅有助于黏膜緩釋?zhuān)€利于黏膜M細(xì)胞的攝取從而增強(qiáng)抗原提呈。特別是COS，具有水溶性、低粘度和低分子量特性，更有助于制備多糖-

7、DNA多聚復(fù)合物。因此我們采用chitosan（殼聚糖）、COS（殼寡糖）與上述經(jīng)改造的多表位基因疫苗共聚形成結(jié)核黏膜基因疫苗，經(jīng)滴鼻免疫，以誘導(dǎo)的肺淋巴細(xì)胞中IFN-γ+T細(xì)胞比例和肺灌洗液SIgA水平來(lái)評(píng)價(jià)其黏膜免疫效果;以脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ+T細(xì)胞比例和血清IgG抗體效價(jià)評(píng)價(jià)其全身免疫效果;然后以大劑量BCG攻毒評(píng)價(jià)免疫保護(hù)效果。探討肺黏膜免疫的誘導(dǎo)在抗結(jié)核免疫保護(hù)中的意義。進(jìn)一步，我們采用BCG初免-結(jié)核黏膜基因疫苗滴鼻加強(qiáng)

8、免疫的策略，再次證實(shí)結(jié)核黏膜基因疫苗配合全民已接種的BCG免疫后的免疫保護(hù)效果。獲得以下主要結(jié)果:一、結(jié)核多表位基因疫苗載體(HSP65)的改造及其免疫學(xué)特性研究1)根據(jù)文獻(xiàn)提示:HSP65蛋白第180-188aa中含有自身免疫原性相關(guān)表位。于是對(duì)第二位的苯丙氨酸(Phe)、笫五位的谷氨酰胺(Gln)和第八位的亮氨酸(Leu)分別予以點(diǎn)突變;同時(shí)對(duì)180-188aa整段缺失。針對(duì)pHSP65和pHSP65pep，分別得到4種突變質(zhì)粒，m

9、utant-1(第二位Phe突變Ala)、mutant-2(第五位Gln突變Ala)、mutant-3(第八位Leu突變Ala)及mutant-4（整段缺失）。2)將上述不同載體改造的質(zhì)粒，以未改造的pHSP65pep、pHSP65質(zhì)粒為對(duì)照，分別于0、2、4、6周肌肉注射免疫雌性BALB/c小鼠，每次50μg/只，每組10只小鼠，共4次。3)檢測(cè)所改造質(zhì)粒的結(jié)核特異性免疫原性，發(fā)現(xiàn):與未經(jīng)改造的pHSP65pep結(jié)核基因疫苗相比，mu

10、tant-3和4誘導(dǎo)的結(jié)核特異性IFN-γ+CD4+Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答均無(wú)顯著降低;而mutant-1和2誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答低于未改造基因疫苗。提示:對(duì)載體HSP65蛋白第180-188aa的mutant-3和4的改造，不會(huì)影響HSP65載體的免疫原性及所含表位的免疫原性。4)檢測(cè)各改造質(zhì)粒免疫小鼠可能誘導(dǎo)的自身免疫應(yīng)答和病理，發(fā)現(xiàn):免疫3個(gè)月后，未經(jīng)改造的pHSP65質(zhì)粒免疫的部分小鼠膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)輕度紅腫，血清抗dsDNA抗體有所升高，腎

11、臟和關(guān)節(jié)病理HE染色及免疫復(fù)合物沉積試驗(yàn)發(fā)現(xiàn):原始pHSP65質(zhì)粒具有誘導(dǎo)輕微腎小球腎炎潛能;而各改造質(zhì)粒均未出現(xiàn)大體和病理異常，特別是mutant-4質(zhì)粒，與正常小鼠的腎臟、關(guān)節(jié)組織病理無(wú)異。提示:對(duì)于載體HSP65蛋白第180-188aa的點(diǎn)突變或缺失改造，使以該載體為基礎(chǔ)的結(jié)核基因疫苗誘導(dǎo)自身免疫應(yīng)答的潛能降至最低，而其誘導(dǎo)結(jié)核特異性Th1免疫的能力不變，因此得到顯著改良。5)綜合結(jié)核特異性免疫和自身免疫結(jié)果，選擇HSP65蛋白第

12、180-188aa完全缺失突變質(zhì)粒作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中多表位結(jié)核黏膜基因疫苗，為簡(jiǎn)潔，仍使用pHSP65pep字樣代表。6)利用PET-32a(+)系統(tǒng)，體外表達(dá)并純化得到大量HSP65蛋白。經(jīng)Western Blot鑒定為有活性的HSP65蛋白。二、殼寡糖組裝結(jié)核黏膜基因疫苗的理化性質(zhì)及其免疫原性和抗結(jié)核免疫保護(hù)特性研究為了誘導(dǎo)結(jié)核特異性黏膜免疫，采用兩種來(lái)源于幾丁質(zhì)的天然生物多糖，殼聚糖(chitosan)和殼寡糖(COS)，分別與質(zhì)粒D

13、NA通過(guò)共凝聚法制備了chi-DNA和COS-DNA復(fù)合物顆粒疫苗。研究了其理化特性以及在小鼠體內(nèi)的免疫原性和免疫保護(hù)特性。1)以0.02％的chitosan溶液在酸性條件、0.4％的COS溶液在中性條件，分別與質(zhì)粒DNA復(fù)合形成chitosan-DNA(簡(jiǎn)稱(chēng)chi-DNA)和COS-DNA復(fù)合物顆粒。經(jīng)掃描電鏡和動(dòng)態(tài)光散射證實(shí)為大小均一的球形顆粒，前者顆粒直徑約200-400hm，后者直徑約300-500nm。2)以瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

14、檢測(cè)兩種多糖對(duì)DNA的保護(hù)效果，發(fā)現(xiàn)DNA與殼聚糖或殼寡糖形成緊密大分子復(fù)合物,無(wú)法在電場(chǎng)中泳動(dòng)而留在加樣孔中。以高濃度DNase Ⅰ消化裸露質(zhì)粒DNA很快被降解;而chi-DNA、COS-DNA中的DNA仍完好無(wú)損;如先以高濃度的chitosanase酶解多糖，使DNA被釋放，再加入DNase Ⅰ，DNA可被降解。提示chitosan和COS均能保護(hù)DNA免受酶解。3)體外，以pGL3-Control熒光質(zhì)粒為報(bào)告基因，以chi-DN

15、A、COS-DNA、DNA分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，檢測(cè)熒光表達(dá)強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn):與裸露質(zhì)粒DNA相比，兩種黏膜介質(zhì)均可顯著促進(jìn)報(bào)告基因的細(xì)胞表達(dá)，COS效果好于chitosan。4)以chi-DNA、COS-DNA結(jié)核黏膜基因疫苗與裸露DNA疫苗分別于0、2、4、6周滴鼻免疫BALB/c小鼠，每次50μg，共4次，BCG皮下注射為對(duì)照。5)與裸露基因疫苗相比，黏膜基因疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)了相當(dāng)水平的全身性免疫，即高水平血清IgG和脾臟Th1免疫。在

16、血清IgG方面，COS-DNA和chi-DNA均誘導(dǎo)了較高水平的血清IgG，效價(jià)分別為15000和12000，與裸露結(jié)核基因疫苗誘導(dǎo)的IgG效價(jià)類(lèi)似(12000)，但低于BCG (320000)，其誘導(dǎo)的IgG類(lèi)別均為IgG2a。在脾臟Th1細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)方面，COS-pHSP65pep與chi-pHSP65pep誘導(dǎo)的Th1細(xì)胞比例分別為2.88％和2.53％，顯著高于裸露質(zhì)粒DNA的1.22％和BCG組的0.85％。提示黏膜基因疫苗

17、仍舊可誘導(dǎo)良好的全身性免疫應(yīng)答。6)黏膜免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)主要表現(xiàn)為肺灌洗液SIgA和肺內(nèi)Th1型免疫應(yīng)答。在肺灌洗液SIgA方面，僅有天然多糖COS和chitosan組裝的結(jié)核基因疫苗誘導(dǎo)了高水平的SIgA，效價(jià)分別為1500和1000;裸露質(zhì)粒組誘導(dǎo)的SIgA效價(jià)低于200。而與chitosan相比，COS更為顯著地促進(jìn)了HSP65特異性SIgA抗體親和力成熟。提示黏膜遞送系統(tǒng)組裝基因疫苗才能使其具有誘導(dǎo)特異性黏膜抗體的能力，且殼寡糖(

18、COS)具有比殼聚糖(chitosan)更好的誘導(dǎo)SIgA能力。7)在誘導(dǎo)肺黏膜特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答方面，即肺黏膜IFN-γ+Th1和CTL應(yīng)答方面，首先，胞內(nèi)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn):COS-pHSP65pep誘導(dǎo)的肺臟Th1和CTL細(xì)胞比值為4.53％和7.25％，顯著高于裸露DNA組的1.75％ (Th1)、2.68％ (CTL)和BCG組的2.05％ (Th1)、3.41％ (CTL)，略高于chi-pHSP65pep的3.87％ (Th1

19、)和5.13％(CTL)。其次，ELISPOT結(jié)果顯示:與DNA和BCG組相比，COS-DNA和chi-DNA顯著增加肺內(nèi)IFN-γ+Th1細(xì)胞數(shù)量，分別為220/120 SFC/106細(xì)胞，相比COS-DNA效果更為顯著。提示滴鼻給予COS-DNA最為顯著地促進(jìn)了全身及黏膜部位Th1型免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。8)經(jīng)大劑量BCG攻毒后4周，檢測(cè)結(jié)核黏膜基因疫苗的免疫保護(hù)效果。發(fā)現(xiàn):①不免疫小鼠攻毒后產(chǎn)生了嚴(yán)重的肺部炎癥灶和組織損傷，提示肺結(jié)核的

20、產(chǎn)生。②各免疫組相比，裸露結(jié)核基因疫苗滴鼻免疫的保護(hù)效果有限，肺臟中可見(jiàn)明顯炎性病灶，肺泡結(jié)構(gòu)有擴(kuò)張性改變;而經(jīng)COS和chitosan遞送的黏膜基因疫苗的免疫保護(hù)顯著增強(qiáng)，特別是COS-pHSP65pep組，僅發(fā)現(xiàn)極小炎癥灶和肺泡上皮組織增厚。③肺臟和脾臟菌落計(jì)數(shù)提示:對(duì)照組的脾、肺結(jié)核桿菌數(shù)達(dá)到105CFU;裸露結(jié)核基因疫苗免疫組小鼠的肺臟和脾臟中，仍有103數(shù)量級(jí)的結(jié)核桿菌;chitosan組裝結(jié)核基因疫苗組臟器細(xì)菌數(shù)降至101數(shù)

21、量級(jí);而經(jīng)COS組裝結(jié)核基因疫苗組臟器細(xì)菌數(shù)降至幾乎檢測(cè)不到。提示黏膜結(jié)核多表位基因疫苗滴鼻免疫可使肺、脾臟的結(jié)核桿菌數(shù)量降低4個(gè)數(shù)量級(jí)。免疫病理和菌落計(jì)數(shù)結(jié)果強(qiáng)烈提示:結(jié)核多表位基因疫苗pHSP65pep具有一定免疫保護(hù)效果;而以COS黏膜遞送系統(tǒng)進(jìn)行黏膜遞送后，因顯著增強(qiáng)了肺黏膜免疫T細(xì)胞和抗體應(yīng)答，從而顯著增強(qiáng)了抗結(jié)核免疫保護(hù)效果。三、BCG初免-殼寡糖組裝結(jié)核黏膜基因疫苗加強(qiáng)免疫策略的抗結(jié)核保護(hù)研究基于我國(guó)普遍計(jì)劃接種BCG的事

22、實(shí)，在應(yīng)用方面，研究BCG初免(prime)-黏膜基因疫苗加強(qiáng)(boost)免疫策略將更具有現(xiàn)實(shí)意義。1) BALB/c小鼠0周時(shí)行皮下初次免疫1×104CFU BCG，再以chi-DNA、COS-DNA復(fù)合物顆粒和裸露DNA疫苗分別于2、4、6周滴鼻加強(qiáng)免疫3次，每次質(zhì)粒50μg，1×104 CFU BCG皮下注射4次組作為陽(yáng)性對(duì)照。2)在血清IgG水平方面:與前次免疫相比，BCG初免-結(jié)核黏膜基因疫苗加強(qiáng)策略顯著增強(qiáng)了HSP65特異

23、性血清IgG水平，效價(jià)均有顯著提高，COS-DNA組和chitosan-DNA組分別誘導(dǎo)了效價(jià)達(dá)120000的IgG，高于裸露質(zhì)粒DNA加強(qiáng)免疫誘導(dǎo)的IgG (50000)。IgG亞類(lèi)仍以IgG2a為主。3)在全身T細(xì)胞應(yīng)答方面:COS-pHSP65pep組脾臟CD4+IFN-γ+T和CD8+IFN-γ+T細(xì)胞比例相對(duì)各組最高，為2.15％和1.57％，顯著高于其他各組(p＜0.05)。提示該策略在脾臟中誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞應(yīng)答為主，CTL

24、應(yīng)答不明顯。4)在肺灌洗液SIgA誘導(dǎo)方面:COS-DNA疫苗加強(qiáng)免疫誘導(dǎo)的SIgA效價(jià)為1300，顯著高于chitosan-DNA疫苗誘導(dǎo)的700;而裸露DNA疫苗加強(qiáng)免疫未能誘導(dǎo)肺灌洗液SIgA，提示COS在增強(qiáng)黏膜抗體應(yīng)答方面的優(yōu)勢(shì)。5)肺黏膜T細(xì)胞應(yīng)答方面:COS-pHSP65pep組誘導(dǎo)了9.32％的CD4+IFN-γ+Th1，顯著高于裸露基因疫苗和BCG組的6.43％和5.68％ (p＜0.001)，同時(shí)，其誘導(dǎo)的肺內(nèi)CTL

25、細(xì)胞比例為9.65％，與chitosan-DNA組結(jié)果類(lèi)似，而顯著高于pHSP65組的6.78％ (p＜0.05)，提示BCG初免后COS仍然能夠顯著增加pHSP65基因疫苗誘導(dǎo)原本難以誘導(dǎo)的肺淋巴細(xì)胞Th1和CTL比例。6)經(jīng)BCG攻毒后，發(fā)現(xiàn):經(jīng)COS和chitosan遞送的黏膜基因疫苗的免疫保護(hù)顯著增強(qiáng)，特別是COS-pHSP65pep組，僅發(fā)現(xiàn)極小炎癥灶和肺泡上皮組織增厚。菌落計(jì)數(shù)提示:對(duì)照組的脾、肺結(jié)核桿菌數(shù)達(dá)到105CFU;

26、chitosan組裝結(jié)核基因疫苗組臟器細(xì)菌數(shù)降至101數(shù)量級(jí);而COS組裝結(jié)核基因疫苗免疫組臟器細(xì)菌數(shù)降至100。提示BCG初免-chitosan/COS黏膜結(jié)核基因疫苗加強(qiáng)策略，顯著增強(qiáng)了結(jié)核基因疫苗的免疫保護(hù)功能。本研究在免疫所前期自主構(gòu)建的結(jié)核多表位基因疫苗pHSP65pep的基礎(chǔ)上，在兩方面進(jìn)行了優(yōu)化。首先，對(duì)其具有一定自身免疫原性的載體HSP65載體蛋白進(jìn)行了缺失突變改造，保留其誘導(dǎo)結(jié)核特異性免疫應(yīng)答能力，但降低了其誘導(dǎo)自身免

27、疫的可能。其次，為更好地誘導(dǎo)肺內(nèi)黏膜免疫，以早期清除肺內(nèi)結(jié)核分枝桿菌，采用兩種黏膜遞送載體介質(zhì):殼聚糖(chitosan)、殼寡糖(COS)與改造后的結(jié)核黏膜基因疫苗，組裝成為具有納米顆粒特性的結(jié)核黏膜基因疫苗chitosan-pHSP65pep和COS-pHSP65pep。經(jīng)滴鼻免疫，證實(shí)上述兩種結(jié)核黏膜基因疫苗在保留誘導(dǎo)全身性免疫應(yīng)答（血清IgG、脾臟T細(xì)胞應(yīng)答）的基礎(chǔ)上，均可顯著增強(qiáng)特異性肺黏膜免疫應(yīng)答，包括裸露基因疫苗難以誘導(dǎo)的

28、肺灌洗液SIgA，和良好水平的肺淋巴細(xì)胞IFN-γ+Th1應(yīng)答。其中，殼寡糖具有比殼聚糖更為顯著的增強(qiáng)黏膜免疫應(yīng)答的能力。經(jīng)攻毒評(píng)估保護(hù)效果發(fā)現(xiàn):兩種結(jié)核黏膜基因疫苗均可增強(qiáng)抗結(jié)核保護(hù)，特別是COS-DNA黏膜基因疫苗，發(fā)揮了最好的免疫保護(hù)能力。最后采用BCG初免-黏膜基因疫苗加強(qiáng)策略，進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)核黏膜基因疫苗增強(qiáng)黏膜免疫和增強(qiáng)抗結(jié)核免疫保護(hù)效果的作用。我們的研究，以誘導(dǎo)肺黏膜免疫為疫苗研制出發(fā)點(diǎn)，創(chuàng)新性地采用兩種幾丁質(zhì)來(lái)源的天然陽(yáng)