高效液相色譜法測(cè)定脊柱結(jié)核中抗結(jié)核藥物濃度的研究.pdf

1、研究背景:
　　 結(jié)核病是一種古老的傳染病,也是伴隨人類歷史最長(zhǎng)的疾病之一,1904年在德國(guó)Heidelberg附近出土的新石器時(shí)代(公元前5000-10000年)人的頸椎骨化石,被發(fā)現(xiàn)已有結(jié)核病變的存在。18世紀(jì)中葉,英國(guó)倫敦的結(jié)核病死亡率高達(dá)900/10萬(wàn),迄今全世界因結(jié)核病而死亡的人數(shù)已達(dá)2億。結(jié)核病被稱為“白色瘟疫”,戰(zhàn)爭(zhēng)和貧窮更是“雪上加霜”,加速了結(jié)核病的傳播和病人的死亡,在人類歷史上演繹了一幕幕的悲劇。至今結(jié)核病仍

2、然是發(fā)展中國(guó)家最嚴(yán)重的傳染病之一,在我國(guó)的歷史上這個(gè)所謂的“癆病”曾經(jīng)奪走了無(wú)數(shù)勞動(dòng)者的生命。新中國(guó)建立以前,民間更有“十癆九死”之說(shuō),可見(jiàn)當(dāng)時(shí)結(jié)核病的猖獗以及老百姓對(duì)結(jié)核病造成的恐怖。直到鏈霉素等抗癆藥的相繼問(wèn)世,再加上解放后政府對(duì)結(jié)核病防治工作的重視,全國(guó)范圍內(nèi)相繼成立了結(jié)核病療養(yǎng)院,防治所和研究所。我國(guó)骨科先輩方先之先生率先開(kāi)展的“骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶清除術(shù)”使骨關(guān)節(jié)結(jié)核和脊柱結(jié)核的治愈率有了很大的提高。20世紀(jì)70年代以后,隨著我國(guó)改

3、革開(kāi)放經(jīng)濟(jì)建設(shè)取得了很大成就,國(guó)民生活水品大幅度提高,結(jié)核病病死率及感染率急劇下降,病例減少,導(dǎo)致一些結(jié)核病防治部門相繼關(guān)門下馬,或改為其他醫(yī)療單位。然而近十年以來(lái)隨著HIV感染和免疫系統(tǒng)疾病患者的增加,加之空氣污染,人們對(duì)結(jié)核病的防范意識(shí)淡薄等因素,使結(jié)核病呈全球性的“死灰復(fù)燃”的趨勢(shì)。目前全世界結(jié)核病患逾2000萬(wàn),每年新增近800萬(wàn),1993年WHO宣布了“全球進(jìn)入結(jié)核病緊急狀態(tài)”。目前在我國(guó)結(jié)核病人數(shù)居世界前位,居于所有傳染病的

4、第一位。其中骨關(guān)節(jié)結(jié)核是主要的肺外結(jié)核之一,當(dāng)前全國(guó)估計(jì)有骨關(guān)節(jié)結(jié)核病人30萬(wàn)左右,曾經(jīng)銷聲匿跡的“癆病”已經(jīng)再現(xiàn)人間,加之抗結(jié)核藥物耐藥性呈增加趨勢(shì),這都向廣大醫(yī)務(wù)工作者和骨科工作者敲響了警鐘和提出了新的要求。
　　 脊柱結(jié)核的外科治療,作為脊柱結(jié)核整個(gè)治療過(guò)程中的一個(gè)階段。在抗癆藥物的基礎(chǔ)上,實(shí)施外科手術(shù)清病灶,可以直接切除病椎并有利于抗結(jié)核藥物滲入病灶,縮短療程,提高治愈率。手術(shù)中一方面對(duì)結(jié)核病灶清除越徹底復(fù)發(fā)率相對(duì)越低,

5、另一方面手術(shù)創(chuàng)傷也越大,手術(shù)時(shí)間出血量也隨之曾加,術(shù)后并發(fā)癥也越多。能不能明確的掌握病灶清除術(shù)中病椎應(yīng)切除的范圍是廣大外科醫(yī)生非常關(guān)心的一個(gè)問(wèn)題,然而對(duì)抗癆藥物在脊柱結(jié)核病椎中的分布情況卻至今鮮有報(bào)道,這對(duì)病椎切除范圍的劃定帶來(lái)了一個(gè)難題。本文采用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)探索出在一個(gè)色譜條件下同時(shí)檢測(cè)出三種抗結(jié)核藥物濃度,分離效果滿意,各峰與血液中內(nèi)源性物質(zhì)互不干擾,方法學(xué)考察適于人體內(nèi)生物樣品的分析,用于臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)和生物等效

6、性評(píng)價(jià)。并借此檢測(cè)方法對(duì)脊柱結(jié)核患者血液,髂骨,病椎,及病椎外亞健康骨中的異煙肼(INH),利福平(RFP)和吡嗪酰胺(PZA)三藥的濃度進(jìn)行了全面檢測(cè)。探討正規(guī)化療后抗結(jié)核藥物在脊柱結(jié)核患者病椎中的分布情況,為脊柱結(jié)核病灶清除術(shù)劃定手術(shù)切除的范圍和術(shù)后化療方案的調(diào)整提供理論依據(jù)。
　　 目的:研究脊柱結(jié)核正規(guī)化療后抗結(jié)核藥物在病椎內(nèi)外分布的特點(diǎn)。為脊柱結(jié)核病灶清除術(shù)劃定手術(shù)切除的范圍和術(shù)后化療方案的調(diào)整提供理論依據(jù)。
　

7、　 方法:
　　 一.研究對(duì)象:
　　 選取我科應(yīng)用2SHRZ/6H2R2Z2短程化療方案[5]結(jié)合手術(shù)治療的初治脊柱結(jié)核患者28例。男16例,女12例；年齡23-71歲,平均36.5歲；頸椎3例,胸椎8例,胸腰椎5例,腰椎10例,腰骶椎2例。28例患者均具備手術(shù)指征,包括脊髓受壓神經(jīng)功能減退,椎體塌陷變形或脊柱后凸畸形,椎旁巨大冷膿腫或?qū)Ψ鞘中g(shù)治療效果欠佳等。全部患者肝腎功能均正常,初治涂陰患者,平均體重57.1kg

8、.全部病例入院后按照2SHRZ/6H2R2Z2方案化療,每日晨督導(dǎo)直視下頓服藥物,劑量為INH 0.3、RFP 0.45、SM 0.75、PZA1.5正規(guī)抗結(jié)核治療4周,待結(jié)核中毒癥狀減輕,血沉<60mm/h或血沉呈持續(xù)下降趨勢(shì),血紅蛋白>100g/L后行手術(shù)治療。術(shù)前先行CT檢查了解病椎情況,28例患者中15例病椎無(wú)硬化骨歸入非硬化骨組(圖1),13例含有病椎硬化骨歸入硬化骨組(圖2)。測(cè)量病灶,硬化壁,亞健康骨和正常椎骨的CT值。2

9、8例脊柱結(jié)核患者當(dāng)中,24例椎體前柱破壞嚴(yán)重,并存在椎旁膿腫,采用側(cè)前方入路經(jīng)胸(胸椎)或經(jīng)腹膜后間隙(腰椎)實(shí)施病灶清除加內(nèi)固定術(shù)。4例病變集中在椎體后部,椎體前方無(wú)明顯膿腫,干酪樣壞死及死骨,或者存在嚴(yán)重腰痛和神經(jīng)損傷癥狀,采用后入路病灶清除植骨,經(jīng)椎弓根內(nèi)固定術(shù)
　　 二.實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)
　　 1.樣本采集:患者術(shù)晨統(tǒng)一空腹服藥并記錄時(shí)間。術(shù)中取患者血液,病灶,“亞健康骨”(即病灶周圍肉眼觀察正常的骨組織),髂骨。因脊

10、柱結(jié)核病灶周圍“亞健康骨”的概念較為模糊,目前尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),為進(jìn)一步探索脊柱結(jié)核抗結(jié)核藥物在病灶周圍骨骼中的分布情況,將“亞健康骨”進(jìn)行分段檢測(cè)。臨床病理學(xué)研究證實(shí),病灶周圍4mm范圍內(nèi)的亞健康骨中仍然存在微小病灶[4],故亞健康骨按病灶邊緣4mm范圍內(nèi)外劃界,距病灶周圍4mm范圍以內(nèi)的“亞健康骨”劃為A段“亞健康骨”,距病灶周圍4mm范圍以外的“亞健康骨”劃為B段“亞健康骨”。術(shù)中用骨孔測(cè)探器尾部刻度測(cè)量后分別取A,B兩段(圖3)。每

11、次取樣時(shí)間嚴(yán)格控制在服藥后2小時(shí)以內(nèi),以保證各藥血藥濃度達(dá)到峰值,提高檢出率。
　　 2.樣品預(yù)處理:靜脈血樣本(5ml)置于肝素抗凝玻璃試管(每管加Vc 1 mg抗氧化),4000轉(zhuǎn)/min離心15min得血漿,再轉(zhuǎn)入EP管,置-70 C0冰箱中待測(cè)。病椎及髂骨用濾紙拭血后稱重(質(zhì)量均大于0.5 g),置-200 C0液態(tài)氮下冷凍后迅速將其取出研磨成粉,置于-50 C0避光下冷凍干燥,再稱重并計(jì)算組織樣本的干濕重量比。分析天平

12、精確稱取200 μg,加入甲醇提取液2 ml渦旋10分鐘后離心,取上清液制成骨組織提取液。取出骨組織提取液1 ml放入EP管中留待測(cè)定其中的血紅蛋白(HB)含量。
　　 3.檢測(cè)色譜條件:色譜柱為分析柱shim-pack BRC-C8(250mm×4.6mm,5μm),保護(hù)柱Eclipse XDB-C18(125min×4.6mm):流動(dòng)相為0.02mol/L,庚烷磺酸鈉溶液(稀磷酸調(diào)pH至3.0)-乙腈-甲醇(78:5:17)

13、6min,(20:5:75)16min,(78:5:17)27min.流速:0.8ml/min,測(cè)試紫外線光波波長(zhǎng)為:PZA:268nm,INH:264nm,RFP:254nm三種抗結(jié)核藥物的保留時(shí)間分別為:PZA:5.62min,INH:10.01min,RFP:24.89min.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:將空白血漿加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋成含INH、RPF、PZA分別為0.1、0.2、0.4、1、2、4、8、16μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)血漿。
　　

14、樣本統(tǒng)計(jì)分析:
　　 采用spss 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(X)±S表示,樣本經(jīng)spss統(tǒng)計(jì)分析,Levene檢驗(yàn)方差齊性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)方差齊性,one-way ANOVA作方差分析,多樣本均數(shù)比較采用Dunnet-t檢驗(yàn),α=0.05。Levene檢驗(yàn)方差不齊,采用welch校正后作方差分析,多樣本均數(shù)比較采用Dunnet-T3檢驗(yàn),α=0.05。
　　 1.血液樣本測(cè)試結(jié)果INH、RPF、PZA血藥濃度與

15、文獻(xiàn)報(bào)道健康人單次服藥的藥時(shí)數(shù)據(jù)相近,各例藥血藥濃度高于髂骨、“亞健康骨”及病椎組織中的藥物濃度,因各藥物血藥濃度遠(yuǎn)高于各藥最低殺菌濃度(10倍MIC),故未與其他樣本作方差分析比較.
　　 2.硬化骨病例測(cè)試結(jié)果
　　 含有硬化骨的13例病灶部分INH、RFP未能測(cè)出藥物濃度,PZA濃度相對(duì)較高。髂骨,A段亞健康骨和B段亞健康骨中抗結(jié)核藥物濃度總體方差具有統(tǒng)計(jì)意義INH(F=17.097 P<0.01)、RFP(F=9

16、.018 P<0.05)、PZA(F=22.510 P<0.01)。A段亞健康骨藥物濃度比髂骨中藥物濃度低,INH:兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),RFP:兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),PZA:兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。B段亞健康骨藥物濃度與髂骨藥物濃度接近,INH:兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),RFP:兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),PZA:兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)
　　 3

17、.非硬化病例測(cè)試結(jié)果
　　 不含有硬化骨的15例病例,髂骨,A段亞健康骨和B段亞健康骨中抗結(jié)核藥物濃度總體方差不具有統(tǒng)計(jì)意義INH(F=2.290 P>0.05)、RFP(F=2.903 P>0.05)、PZA(F=1.223 P>0.05)
　　 4.兩組病灶中的藥物濃度
　　 三種藥物遠(yuǎn)低于各藥物最低抑菌濃度(MIC),特別在硬化骨組中的INH和RFP未能檢測(cè)出藥物濃度,僅PZA能測(cè)出極低的藥物濃度,故對(duì)病灶

18、中的藥物未統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)論:
　　 一.在脊柱結(jié)核病灶中抗結(jié)核藥物濃度低于最低抑菌濃度,手術(shù)時(shí)應(yīng)部分切除。
　　 二.含有硬化壁的病灶周圍4mm范圍內(nèi)“亞健康骨”中藥物濃度仍然較低,手術(shù)時(shí)可考慮部分切除；不含有硬化壁的病灶周圍4mm范圍內(nèi)亞健康骨中藥物濃度相對(duì)較高,手術(shù)時(shí)可予以保留。
　　 三.硬化壁內(nèi)藥物濃度極低,手術(shù)時(shí)應(yīng)徹底清除。硬化壁可能是阻擋藥物滲進(jìn)一步透到病灶中的因?yàn)椤?br>　　 四