HCV腺病毒載體疫苗AdNSmut的構(gòu)建和免疫評價(jià).pdf

1、目的:丙型肝炎病毒(HCV)是全球性傳染性疾病病原體，慢性感染可能引起肝炎、肝纖維化、肝硬化乃至肝癌。傳統(tǒng)治療方法利巴韋林與干擾素聯(lián)用毒副作用較大，且持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率(Sustained virological response，SVR)較低，只有50％-60％。目前已經(jīng)上市的直接抗病毒藥物(Direct acting antiviral agents，DAAs)在某些地區(qū)持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率高達(dá)90％以上。然而DAAs治療存在以下缺點(diǎn):藥

2、物在疾病晚期不能逆轉(zhuǎn)惡性化進(jìn)展;DAAs藥物價(jià)格昂貴，患者常無力負(fù)擔(dān);DAAs對于某些亞型HCV感染治療效果較差;藥物的使用不能防止新發(fā)感染;病毒易出現(xiàn)耐藥性變異。接受DAAs治療的患者，若是目前或曾經(jīng)感染過HBV，再次感染還會導(dǎo)致嚴(yán)重肝損傷甚至死亡。因此，HCV疫苗的制備對于疾病的防治非常重要。當(dāng)前研究中HCV疫苗種類有:重組蛋白疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗等。有多個(gè)疫苗進(jìn)入了Ⅰ/Ⅱ臨床試驗(yàn)，DNA疫苗ChronVac-C

3、、腺病毒載體疫苗Ad6-NS、ChAd3-NS等不僅可以在健康人體內(nèi)誘發(fā)有效的體液免疫反應(yīng)，還可以在慢性感染的患者體內(nèi)提高干擾素加利巴韋林的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率。HCV疫苗制備的主要障礙是基因序列的高度異質(zhì)性，因此在一定的地域，應(yīng)該根據(jù)該地區(qū)流行的HCV基因型序列片段。腺病毒載體疫苗以其安全有效、持續(xù)時(shí)間長、激發(fā)免疫反應(yīng)強(qiáng)等特點(diǎn)成為疫苗研發(fā)較好的選擇。特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)對于HCV的清除起到?jīng)Q定性的作用。因此，選取能激發(fā)顯著細(xì)胞免疫的1b型H

4、CV NS3-5Bmut片段，構(gòu)建候選疫苗AdNSmut，并初步在小鼠上對NS3-5Bmut片段進(jìn)行免疫原性評價(jià)，以期為后續(xù)HCV候選疫苗的臨床前評價(jià)提供可供選擇的免疫原和接種方案。
　　方法:PCR從1b型HCV基因中擴(kuò)增獲得NS3-NS5B片段，定點(diǎn)突變NS5B基因使RNA聚合酶失去活性，獲得NS3-NS5Bmut片段。將該目的片段連接入腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315中，Western blot和免疫熒光鑒定該質(zhì)粒外源基因NS3，

5、NS5B蛋白的表達(dá)。重組穿梭質(zhì)粒pDC315-NS3-5Bmut(縮寫為pDC315-NSmut)與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，獲得復(fù)制缺陷型重組腺病毒AdNSmut，PCR檢測外源基因完整性，RT-PCR檢測mRNA轉(zhuǎn)錄情況，Western blot與質(zhì)譜檢測病毒感染細(xì)胞NS3-NS5B蛋白的表達(dá)。大量擴(kuò)增并純化AdNSmut腺病毒，測定病毒滴度。選擇C57BL/6小鼠作為動(dòng)物模型，分為接種緩沖液的安慰劑組、接種AdEGFP的陰

6、性對照組、接種AdNSmut的實(shí)驗(yàn)組。不同病毒注射組分別肌肉注射108PFU、109PFU、1010PFU、1011PFU的AdEGFP或AdNSmut，經(jīng)過初次免疫3周，加強(qiáng)免疫2周后分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，Elispot和流式胞內(nèi)染色檢測細(xì)胞免疫反應(yīng)，眼球取血檢測體液免疫反應(yīng)。
　　結(jié)果:PCR擴(kuò)增獲得HCV1b NS3-5Bmut序列，成功構(gòu)建pDC315-NSmut穿梭質(zhì)粒，免疫熒光和Western blot證實(shí)該質(zhì)粒能表達(dá)

7、正確的NS3NS5B外源蛋白。重組穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，包裝產(chǎn)生了具有感染性且表達(dá)外源基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒AdNSmut。純化后獲得滴度為2.74×1013PFU/ml的高純度高滴度病毒，用于免疫接種C57BL/6小鼠，免疫后檢測到接種AdNSmut的小鼠有顯著的HCV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。
　　結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了能夠表達(dá)1b型HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3-5Bmut的復(fù)制缺陷型重組腺病毒AdNSmut。該重組腺