表達HCV-NS3抗原的重組腺病毒載體疫苗的實驗研究.pdf

1、由于丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)有多種基因型以及基因序列的高度變異性，使按傳統(tǒng)方式研制HCV疫苗面臨著諸多困難，而將編碼目的抗原的外源基因?qū)胧芙臃N者的各類新型疫苗可望成為一條新的思路。以重組復(fù)制缺陷型腺病毒(replication-deficientrecombinantadenovirus，RAd)為載體的疫苗，能有效地將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞內(nèi)并使之高效表達，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對目的抗原的免疫應(yīng)答，因此，我們構(gòu)

2、建了可表達HCV非結(jié)構(gòu)蛋白3(non-structuralprotein3，NS3)的重組腺病毒RAd-NS3，并觀察其免疫小鼠后，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的能力，為研制丙型肝炎疫苗探索新的途徑。 方法：以真核表達質(zhì)粒pRc/NS3為模板，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)技術(shù)擴增編碼NS3蛋白(302～935aa)的基因片段，定向克隆到重組腺病毒AdEasy-1系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒pAdTr

3、ack-CMV上，構(gòu)建了重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-NS3；經(jīng)酶切及測序鑒定確認(rèn)后與腺病毒基因組質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化BJ5183菌，利用細(xì)菌內(nèi)同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-NS3；轉(zhuǎn)染293細(xì)胞以包裝、擴增重組腺病毒，并用同樣的方法制備對照空載腺病毒Ad-Track。利用重組腺病毒體外感染人肝癌細(xì)胞株HepG2，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptpolymerasechainreaction，

4、RT-PCR)及免疫印跡等不同方法檢測HCV-NS3蛋白的表達。將重組腺病毒RAd-NS3和對照腺病毒Ad-Track以108pfu劑量經(jīng)皮下注射途徑免疫BALB/c小鼠，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)檢測免疫小鼠血清抗體水平，51Cr釋放法檢測免疫小鼠細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)體外殺傷功能。 結(jié)果：成功構(gòu)建了表達HCV

5、-NS3抗原的重組腺病毒疫苗RAd-NS3，并檢測其在體外感染細(xì)胞中能有效表達HCV-NS3蛋白；用重組腺病毒RAd-NS3免疫小鼠后可刺激機體產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，抗HCV-NS3最高滴度可達1：10000，在觀察的10周內(nèi)抗體平均滴度在1：1000；無論是一次免疫還是多次免疫，免疫小鼠均可誘生出NS3特異性的CTL活性，最高為53.2％，顯著高于重組質(zhì)粒免疫組(P＜0.01)；未觀察到明顯的毒副作用。 結(jié)論：