腺病毒載體AD-BDNF-EGFP的構建和在神經(jīng)干細胞中的表達.pdf

1、隨著現(xiàn)代交通以及建筑的發(fā)展，脊髓損傷(spinal cord injury SCI)患者的數(shù)量與日俱增。外傷性的脊髓損傷危害嚴重，常導致截癱。包括外科手術、藥物治療等在內(nèi)，很多方法正在用于治療脊髓損傷，恢復患肢功能。神經(jīng)干細胞(NSCs)移植是一種新的治療方法，植入的細胞可以替代受損區(qū)域的細胞，促進神經(jīng)元回路的重建，恢復脊髓功能。本研究是通過分子生物學技術，在體外構建整合有BDNF基因的腺病毒載體，感染體外培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)干細胞，誘導細胞

2、向神經(jīng)元分化。為以后干細胞體內(nèi)移植治療脊髓損傷提供實驗依據(jù)。 第一部分脊髓源性性神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)與分化 目的: 探討大鼠脊髓源性胚胎神經(jīng)干細胞體外分離培養(yǎng)增殖及分化，為進一步的實驗研究提供基礎。 方法: 取孕14～16 d的SD大鼠胚胎脊髓在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)增殖傳代分化，用神經(jīng)干細胞特異性抗體一巢蛋白(Nestin)鑒定克隆細胞，用特異性的單克隆抗體鑒定克隆球誘導分化后的細胞。用Brdu免疫熒光對神經(jīng)干細胞傳代能

3、力檢測。 結果: 獲得了大量能自我增殖并分化的細胞，分化后主要產(chǎn)生神經(jīng)元特異性微管相關蛋白(MAP-2)染色陽性的神經(jīng)元質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)陽性的星行膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的神經(jīng)干細胞。Brdu免疫熒光顯示神經(jīng)球中絕大多數(shù)細胞為Brdu．陽性細胞，其細胞核中可見熒光標記物。 結論: 該種方法培養(yǎng)的細胞：①具備生長因子反應性，即只有在堿性成纖維生長因子的存在下方可表現(xiàn)出增殖能力并形成所謂的“神經(jīng)球”樣懸浮小體；②可在

4、體外傳代并維持增殖活性；③神經(jīng)球內(nèi)的大多數(shù)細胞為nestin陽性；④來自一個神經(jīng)球的細胞可分化產(chǎn)生3種主要的神經(jīng)細胞，即培養(yǎng)細胞具有多向分化的潛能。因而本研究培養(yǎng)的細胞具備了神經(jīng)干細胞的基本特性，為接下來的實驗提供基礎。 第二部分腺病毒載體Ad-BDNF-EGFP的構建和在神經(jīng)干細胞中的表達 目的: 腺病毒載體Ad-BDNF-EGFP的構建和在神經(jīng)干細胞中的表達情況的檢測。 方法: 通過RT-PCR成功從在大鼠的

5、海馬中獲得BDNF基因，通過基因克隆以及HEK293包裝，獲得了含增強綠色熒光蛋白(EGFP)基因的重組腺病毒表達載體pAd-BDNF-EGFP，將其感染原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞，觀察EGFP及BDNF兩種基因的表達，鏡下測定轉(zhuǎn)染率，并對RT-PCR產(chǎn)物檢測證實BDNF的存在。轉(zhuǎn)染后的神經(jīng)干細胞經(jīng)G418篩選，抗性細胞傳代擴增后獲得成功轉(zhuǎn)染BDNF基因的NSCs克隆。 結果: 熒光顯微鏡下可見感染后的NSCs表達EGFP而發(fā)出綠色熒

6、光；通過RT-PCR證明感染后的NSCs具有表達BDNF的能力；用ELISA鑒定細胞上清中分泌的BDNF，72h的含量達到最高，為11.68ng/ml；證明通過構建病毒的感染可以使神經(jīng)干細胞獲得分泌BDNF的能力，并且EGFP基因可作為神經(jīng)干細胞移植研究中良好的示蹤劑。 結論: 腺病毒病毒介導EGFP基因以及BDNF基因在大鼠胚胎神經(jīng)干細胞中成功表達，為我們應用分子生物學、基因技術，以神經(jīng)干細胞直接作為基因靶細胞，介導基因治療中