NNMT在鎳誘導(dǎo)的BEAs-2B細(xì)胞組蛋白H3甲基化中的作用研究.pdf

1、背景：
　　鎳化合物在工業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用不可避免地會造成職業(yè)人群的健康危害。流行病學(xué)研究表明，與在非鎳暴露的場所中的工作人員相比，鎳礦工人中因患肺癌的死亡率明顯增高，鎳的化合物已經(jīng)被國際癌癥研究中心(IARC)正式確立為一類致癌物。近來的研究表明，組蛋白甲基化參與了鎳誘導(dǎo)肺癌的早期階段。尼克酰胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(NNMT)與癌細(xì)胞的增殖、遷移等生物學(xué)特征密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)NNMT可以減少細(xì)胞內(nèi)腺苷甲硫氨酸/腺苷同型半胱氨酸(SA

2、M/SAH)比值導(dǎo)致組蛋白甲基化水平降低。而目前，尚未見文獻(xiàn)報道鎳暴露能通過影響NNMT的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)組蛋白甲基化。本課題主要研究NNMT是否參與了鎳引起的組蛋白甲基化，并初步探討鎳引NAD/NADH比值改變在鎳導(dǎo)致的NNMT表達(dá)抑制以及H3K9me2水平升高中的作用，為闡明鎳引起組蛋白甲基化的機(jī)制提供新的線索。
　　內(nèi)容：
　?、賹⒅夤苌掀ぜ?xì)胞(BEAS-2B)暴露于不同濃度的氯化鎳(NiCl2)72h以及在200μM

3、NiCl2處理0h、12h、24h、48h和72h。采用CCK-8試劑盒檢測氯化鎳暴露后BEAS-2B細(xì)胞活性的變化。用Western blot檢測氯化鎳暴露后，組蛋白H3第9位賴氨酸單甲基化(H3K9me1)、雙甲基化(H3K9me2)和三甲基化(H3K9me3)以及NNMT蛋白的表達(dá)水平，RT-PCR用于檢測H3K9me2下游的肺癌抑癌基因MAP2K3和DKK1以及NNMT mRNA的表達(dá)水平。
　?、诓捎眉?xì)胞轉(zhuǎn)染的方法使BE

4、AS-2B細(xì)胞過表達(dá)NNMT，觀察NNMT過表達(dá)后，經(jīng)氯化鎳處理后的細(xì)胞中H3K9me2及其下游抑癌基因MAP2K3和DKK1的表達(dá)變化，用HPLC檢測細(xì)胞中SAM/SAH比值的變化。
　?、塾肗ADH氧化劑檸嗪酸(phenazine methosulfate，PMS)處理經(jīng)氯化鎳暴露后的細(xì)胞，檢測細(xì)胞內(nèi)NAD/NADH比值的變化，用Western blot和RT-PCR檢測NNMT、H3K9me2及其下游抑癌基因MAP2K3和D

5、KK1的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　①氯化鎳引起組蛋白H3第9位賴氨酸甲基化中H3K9me2水平增加，并下調(diào)其下游抑癌基因MAP2K3和DKK1的表達(dá)。
　?、诼然囈种艬EAS-2B細(xì)胞中NNMT的表達(dá)，NNMT可以通過降低細(xì)胞內(nèi)SAM/SAH比值參與鎳引起的H3K9me2升高以及MAP2K3和DKK1表達(dá)水平降低。
　?、跴MS可以抑制鎳引起的H3K9me2升高以和抑癌基因MAP2K3和DKK1表達(dá)下調(diào)，但不

6、能拮抗鎳導(dǎo)致的BEAS-2B細(xì)胞中NNMT的表達(dá)抑制。
　　結(jié)論：
　　根據(jù)本研究的結(jié)果，得出結(jié)論:鎳導(dǎo)致的NNMT表達(dá)抑制參與了鎳誘導(dǎo)的H3K9me2水平增加，NNMT可以通過改變細(xì)胞內(nèi)SAM/SAH的比值調(diào)控鎳引起的H3K9me2升高。氯化鎳導(dǎo)致的NAD/NADH比值下降沒有在鎳抑制NNMT表達(dá)中起作用，但是NAD/NADH比值的改變參與了鎳導(dǎo)致H3K9me2水平升高這一過程。本研究為解釋鎳引起組蛋白甲基化狀態(tài)改變提供了