卵巢粒層細(xì)胞瘤中抑癌基因甲基化及組蛋白甲基化的研究.pdf

1、目的:卵巢粒層細(xì)胞瘤是一種少見的卵巢性索-間質(zhì)腫瘤，約占卵巢惡性腫瘤的2-5％左右，按照其組織病理學(xué)類型可分為成年型及幼年型，其中以成人型最為多見，目前發(fā)生機(jī)制不明;粒層細(xì)胞瘤的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，主要為腹痛腹脹、內(nèi)分泌紊亂及腹部包塊，術(shù)前一般難以明確診斷，確診主要靠術(shù)后病理;鏡下形態(tài)復(fù)雜多樣，按腫瘤細(xì)胞的排列方式可以分為微濾泡型、小梁型、島狀型及彌漫型等，各種方式常以不同比例混合存在，為粒層細(xì)胞瘤的診斷及組織學(xué)分級(jí)造成困難;粒層細(xì)胞瘤

2、的診斷指標(biāo)相對(duì)單一，主要為常規(guī)HE染色加免疫組織化學(xué)染色輔助，而現(xiàn)階段用于粒層細(xì)胞瘤診斷的一線免疫組化抗體如a-inhibin、CD99、calretinin、EMA、vimentin等的敏感性和特異性均難以滿足日常工作的需要;在治療和預(yù)后方面，粒層細(xì)胞瘤具有低度惡性、遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)的特性，迄今為止尚無充分的證據(jù)表明放化療能延緩或預(yù)防其復(fù)發(fā)。近年來，表觀遺傳學(xué)的發(fā)展突飛猛進(jìn)，表觀調(diào)控異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系亦成為新的研究熱點(diǎn)。表觀調(diào)控異常是指

3、不發(fā)生DNA序列變化的基因表達(dá)的改變，主要包括DNA甲基化及組蛋白甲基化。越來越多的研究顯示，抑癌基因啟動(dòng)子甲基化及組蛋白甲基化可以沉默相應(yīng)抑癌基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用;研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)DNA甲基化及組蛋白甲基化均具有可逆轉(zhuǎn)特性，去甲基化處理可以重新激活沉默的抑癌基因的表達(dá)，發(fā)揮抑癌功能，從而使甲基化酶抑制劑類藥物的研究成為抗腫瘤治療的新思路。本課題擬通過對(duì)卵巢粒層細(xì)胞瘤(Ovary.Granulosa CellTumo

4、rs，GCTs)中抑癌基因啟動(dòng)子甲基化及組蛋白甲基化狀況的研究，為粒層細(xì)胞瘤的發(fā)生機(jī)制、診斷及治療尋找新的研究靶點(diǎn)。
　　方法:(1)收集2010-2013年間齊魯醫(yī)院及單縣中心醫(yī)院成人型卵巢粒層細(xì)胞瘤共30例作為研究對(duì)象（年齡23-71歲，中位年齡50歲），同時(shí)收集卵巢濾泡囊腫30例作為對(duì)照，其中五例為上述粒層細(xì)胞瘤合并的對(duì)側(cè)卵巢濾泡囊腫，另25例為同時(shí)期同年齡段因子宮肌瘤等病變手術(shù)時(shí)切除的卵巢濾泡囊腫。(2)所用病例均經(jīng)齊魯醫(yī)

5、院病理科兩名高級(jí)職稱專家雙盲復(fù)審閱片，證實(shí)診斷準(zhǔn)確可靠，同時(shí)挑選出合適的組織蠟塊。(3)收集所有粒層細(xì)胞瘤患者的臨床病理指標(biāo)，包括年齡、腫瘤大小、FIGO分期、有無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。(4)運(yùn)用甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MSP)檢測30例卵巢粒層細(xì)胞瘤組織標(biāo)本及30例卵巢濾泡囊腫組織標(biāo)本中3個(gè)抑癌基因(tumor supper-ssor genes，TSGs) CDH13，DKK3，F(xiàn)OXL2啟動(dòng)子的甲

6、基化狀態(tài)。(5)采用免疫組織化學(xué)(immunohistochemi-stry，IHC)兩步法檢測組蛋白甲基化酶EZH2蛋白在卵巢粒層細(xì)胞瘤及濾泡囊腫標(biāo)本中的表達(dá)狀況。(6)利用Fisher's確切概率法分析抑癌基因(CDH13，DKK3，F(xiàn)OXL2)甲基化與卵巢粒層細(xì)胞瘤臨床病理特征的相關(guān)性。(7)利用Fisher's確切概率法分析組蛋白甲基化酶EZH2的表達(dá)與卵巢粒層細(xì)胞瘤臨床病理特征的相關(guān)性。(8)利用X2檢驗(yàn)法分析抑癌基因(CDH

7、13，DKK3，F(xiàn)OXL2)甲基化率與組蛋白甲基化酶EZH2表達(dá)率的相關(guān)性。(9)從上述30例粒層細(xì)胞瘤中隨機(jī)挑選出10例，利用巢氏PCR法對(duì)10例粒層細(xì)胞瘤進(jìn)行SNP檢測，檢測CDH13，DKK3外顯子及FOXL2突變熱點(diǎn)C134W基因序列有無改變。
　　結(jié)果:(1)在30例卵巢粒層細(xì)胞瘤中三個(gè)抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2的甲基化率分別為86.67％、80％和70％，顯著高于濾泡囊腫（分別為23.33％、26.67％

8、和20％），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均顯示p＜0.01。(2)30例卵巢粒層細(xì)胞瘤中11例EZH2蛋白呈陽性表達(dá)（陽性率為36.7％），而30例濾泡囊腫組織均呈陰性（陽性率為0％），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.01。(3)本組數(shù)據(jù)未發(fā)現(xiàn)粒層細(xì)胞瘤中三個(gè)抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2的甲基化與臨床病理指標(biāo)間（年齡、腫瘤大小、FIGO分期及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)情況）存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(P＞0.05)。(4)本組數(shù)據(jù)未發(fā)現(xiàn)粒層細(xì)胞瘤中組蛋白甲基化酶E

9、ZH2的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)間（年齡、腫瘤大小、FIGO分期及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)情況）存在統(tǒng)計(jì)學(xué)的相關(guān)性(P＞0.05)。(5)本組數(shù)據(jù)未發(fā)現(xiàn)卵巢粒層細(xì)胞瘤中抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2的甲基化率與組蛋白甲基化酶EZH2的表達(dá)率之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(P＞0.05)。(6)10例粒層細(xì)胞瘤中，CDH13全部外顯子未發(fā)現(xiàn)有集中突變點(diǎn)，僅個(gè)別病例在二、五、九號(hào)外顯子檢測到散在的突變點(diǎn);(7)10例粒層細(xì)胞瘤中有4例在DKK3基因七號(hào)外顯子檢測

10、到A--＞G突變;10例粒層細(xì)胞瘤均發(fā)現(xiàn)在FOXL2-C134W位點(diǎn)存在C--＞G突變。
　　結(jié)論:(1)三個(gè)抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2啟動(dòng)子甲基化率均達(dá)到70％及以上，并顯著高于卵巢濾泡囊腫，提示三者的甲基化在卵巢粒層細(xì)胞瘤中屬于頻發(fā)事件，推測其在卵巢粒層細(xì)胞瘤的發(fā)生中具有重要作用，可以作為粒層細(xì)胞瘤敏感性較強(qiáng)的診斷性指標(biāo)。(2)粒層細(xì)胞瘤中組蛋白甲基化酶ZEH2的表達(dá)率雖低于抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL

11、2的甲基化率，但顯著高于其在濾泡囊腫中的表達(dá)率，且在全部30例濾泡囊腫中失表達(dá)，提示組蛋白甲基化可能在粒層細(xì)胞瘤的發(fā)生中發(fā)揮一定作用;同時(shí)提示其作為粒層細(xì)胞瘤診斷性指標(biāo)，敏感性較差，而特異性較高，可以和CDH13，DKK3及FOXL2甲基化聯(lián)合應(yīng)用，提高卵巢粒層細(xì)胞瘤診斷率。(3)本課題未發(fā)現(xiàn)抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2啟動(dòng)子甲基化及組蛋白甲基化酶EZH2的表達(dá)率與粒層細(xì)胞瘤的臨床病理指標(biāo)存在相關(guān)性，提示CDH13，DKK3

12、和FOXL2啟動(dòng)子甲基化及組蛋白甲基化可能是卵巢粒層細(xì)胞瘤發(fā)生的早期事件，與其發(fā)生有關(guān)，而與其進(jìn)展及預(yù)后無關(guān);亦可能與粒層細(xì)胞瘤自身低度惡性、進(jìn)展緩慢和遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)的特性有關(guān)，需要進(jìn)行長期隨訪進(jìn)一步研究分析;抑或與本課題研究樣本小有關(guān)，需要有大樣本的研究進(jìn)一步探討。(4)組蛋白有多種不同的甲基化模式，EZH2可靶向催化H3K27發(fā)生三甲基化，并進(jìn)一步發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用。本課題未發(fā)現(xiàn)粒層細(xì)胞瘤中抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2啟動(dòng)

13、子甲基化率與組蛋白甲基化酶EZH2表達(dá)率之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，DNA甲基化與組蛋白H3K27甲基化之間可能不存在交互作用。提示在粒層細(xì)胞瘤中，某些抑癌基因的甲基化與組蛋白的某種類型甲基化可能通過各自的途徑沉默抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)粒層細(xì)胞瘤的發(fā)生。(5)本課題在10粒層細(xì)胞瘤中未檢測到CDH13的十四個(gè)外顯子存在集中突變點(diǎn)，僅個(gè)別病例在個(gè)別外顯子檢測到散在突變點(diǎn)，提示CDH13啟動(dòng)子甲基化可能單獨(dú)起作用，不改變基因序列而沉默相關(guān)基因的表達(dá)

14、，降低相關(guān)蛋白水平，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。逆轉(zhuǎn)啟動(dòng)子的甲基化則可能重新啟動(dòng)CDH13的表達(dá)活性，使相應(yīng)的RNA轉(zhuǎn)錄量及蛋白水平顯著增加，發(fā)揮抑癌作用。(6)10例粒層細(xì)胞瘤中有4例在DKK3基因七號(hào)外顯子檢測到A--＞G突變，文獻(xiàn)中尚未見報(bào)道，可以經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯造成相應(yīng)的氨基酸由精氨酸R轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼酖，有可能因此而改變相應(yīng)蛋白的功能，與DKK3啟動(dòng)子甲基化共同作用，促進(jìn)粒層細(xì)胞瘤的發(fā)生;有關(guān)DKK3七號(hào)外顯子在其他腫瘤中是否存在A--＞G突變

15、及其意義，文獻(xiàn)中尚未見相關(guān)報(bào)道。(7)本課題研究發(fā)現(xiàn)10例卵巢粒層細(xì)胞瘤中FOXL2-C134W位點(diǎn)均存在C--＞G突變，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，是成人型卵巢粒層細(xì)胞瘤的一個(gè)特征性分子事件。(8)本課題發(fā)現(xiàn)在10例卵巢粒層細(xì)胞瘤有7例同時(shí)發(fā)生FOXL2啟動(dòng)子高甲基化與FOXL2-C134W的C--＞G突變，3例同時(shí)發(fā)生DKK3啟動(dòng)子的高甲基化與DKK3七號(hào)外顯子A--＞G突變，提示在卵巢粒層細(xì)胞瘤中，特定抑癌基因的甲基化可能通過某種機(jī)制造成特點(diǎn)

16、位點(diǎn)基因序列的改變;亦有可能作為表觀調(diào)控的異常，抑癌基因啟動(dòng)子甲基化本身并不改變基因序列，但可能與基因突變同時(shí)存在。若二者為同時(shí)存在，逆轉(zhuǎn)啟動(dòng)子的甲基化則無法同時(shí)逆轉(zhuǎn)基因序列的改變，并不能重新激活基因的表達(dá)活性，單純?nèi)ゼ谆委焺t可能無效，從而為以去甲基化為靶點(diǎn)的藥物的研發(fā)作出了有益的提示。因本研究樣本較小，無法對(duì)DKK3啟動(dòng)子的高甲基化與DKK3七號(hào)外顯子A--＞G突變、FOXL2啟動(dòng)子甲基化與FOXL2-C134W位點(diǎn)突變的相關(guān)性作