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文檔簡介
1、目的:
調節(jié)性T細胞(Regulatory T cells,Treg)在自身免疫耐受和免疫自穩(wěn)中起著非常關鍵的作用,其在胸腺內發(fā)育成為一類獨立的CD4+T細胞亞群。許多研究結果都觀察到表觀遺傳調控對于控制Treg細胞基因特別是Forkhead家族轉錄因子3(the forkhead/winged-helix protein3,F(xiàn)OXP3)的表達起到很關鍵的作用。Treg細胞和普通的T細胞相比,F(xiàn)OXP3基因不同區(qū)域的DNA甲基
2、化和特異性的組蛋白修飾方式是不同的。但是目前的研究主要還是集中在DNA的甲基化是如何調控Treg基因的表達,關于組蛋白修飾,特別是與啟動子相關的H3K4me3修飾(trimethylated histone H3 lysine4)和與增強子相關的H3K4me1修飾(monomethylated histone H3 lysine4),對于Treg細胞基因表達的調節(jié)作用研究很少。
因此,本研究擬采用ChIP-Seq的技術,繪制并
3、比較Treg細胞和aTconv細胞H3K4me3和H3K4me1修飾的全基因組圖譜,從而對H3K4me3和H3K4me1這兩種修飾在Treg細胞基因表達中的調節(jié)作用進行了初步的探討。
實驗方法:
一、人CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞的體外擴增和純化:
1.人CD4+CD25+Treg細胞的分離和純度檢測:用磁珠分選(magnetic-activated cell-sorting,MACS)的方法
4、從人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中分離CD4+CD25+T細胞;用流式細胞術(flow cytometry,F(xiàn)CM)的方法檢測分選后細胞的純度;
2.人CD4+CD25+Treg細胞的體外擴增與純度檢測:用Invitrogen公司人Treg細胞體外擴增試劑盒進行Treg細胞的體外擴增;用FCM的方法檢測擴增過程中FOXP3+細胞的純度;
3.擴增
5、后細胞的抑制功能檢測:擴增后細胞與CFSE(5-and-6 carboxy fluorescein diacetate succinimidyl ester)標記的CD4+CD25-T細胞不同比例混合(0:1,1:1,1:2,1:4),F(xiàn)CM檢測CD4+CD25-T細胞的增殖情況;
4.擴增后細胞進行流式細胞分選:用CD4、CD25和FOXP3三個標記對擴增后的細胞進行流式細胞分選(fluorescence activated
6、 cell sorting,F(xiàn)ACS),分選出CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞和CD4+CD25+FOXP3-T(aTconv)細胞。
二、H3K4me3和H3K4me1在人Treg細胞基因表達調控中的作用:
1.染色質免疫共沉淀實驗(chromatin immunoprecipitation,ChIP)及高通量測序前后已知位點的實時定量PCR(quantitative real-time PCR,QPCR
7、)檢測:用抗H3K4me3抗體和抗H3K4me1抗體及其陰性對照抗體IgG對擴增后的Treg細胞和aTconv細胞進行ChIP;用ChIP-QPCR的方法對選取的陽性位點進行檢測,我們選取了部分與Treg細胞功能相關基因的啟動子或者H3K4me1位點作為陽性位點,例如FOXP3,白介素2受體α(interleukin2 receptor alpha,IL2RA),糖皮質激素誘導腫瘤壞死因子受體(glucocorticoid induce
8、d tumor necrosis factor receptor,GITR),細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4),趨化因子受體7(chemokine(C-Cmotif) receptor7,CCR7)以及信號傳導與轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)家族;<
9、br> 2.ChIP樣本的高通量測序(high-throughput sequencing)及生物信息學分析:將ChIP DNA樣本送往深圳華大基因研究所,使用Solexa1G Genome Analyzer高通量側測序儀進行高通量測序;用比對軟件SOAP(short oligonucleotide analysis package)將測序數(shù)據與人類基因組序列進行比對,獲得唯一比對的reads;用MACS(Model-based An
10、alysis for ChIP-Seq)方法進行全基因組peaks的掃描,獲得H3K4me3 peaks和H3K4me1 peaks;
3.Treg細胞和aTconv細胞的H3K4me3和H3K4me1修飾的全基因組圖譜及其比較:人類基因組分為四個部分,即近端啟動子區(qū)(proximal promoters)、外顯子區(qū)(exons)、內含子區(qū)(introns)、基因間區(qū)(intergenic sequences),統(tǒng)計Peaks
11、在這些區(qū)域分布的比例;通過生物信息學鑒定Treg細胞或者aTconv細胞之間共有的或者特異性的H3K4me3 peaks、H3K4me1 peaks、H3K4me3 proximal promoters以及proximal promoters相關基因;
4.Treg細胞和aTconv細胞特異性或者共有基因的H3K4me3和H3K4me1修飾特征:選取與Treg細胞功能密切相關的基因,例如FOXP3,IL2RA,CTLA4、TN
12、FRSF18、STAT家族和CCR7等,將ChIP-Seq數(shù)據在UCSC Genome Browser以圖形化的方式展示,比較這些基因H3K4me3和H3K4me1的修飾特征;用QPCR的方法鑒定這些基因在這兩類細胞之間的mRNA表達水平差異;
5.Treg細胞和aTconv細胞特異性或者共有的H3K4me1位點的功能鑒定:運用雙熒光素酶報告基因實驗來證實候選的H3K4me1片段是否具有增強子的活性。
實驗結果:
13、r> 第一部分:人CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞的體外擴增和純化
1.MACS的方法從PBMC中分離了CD4+CD25+T細胞,通過流式細胞儀檢測CD4+CD25+T細胞的純度為93.7%;
2.用Invitrogen公司商品化的人CD4+CD25+Treg細胞體外擴增試劑盒對MACS分選的細胞進行擴增,擴增70天后,細胞絕對數(shù)擴大了1000倍以上;但是在細胞擴增的整個過程中,我們通過CD4、CD25和
14、FOXP3這三個標志進行Treg細胞純度的檢測,結果發(fā)現(xiàn)隨著細胞絕對數(shù)的不斷增加,CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞的純度不斷降低;
3.CFSE標記的CD4+CD25-T細胞與體外擴增的CD4+CD25+T細胞分別按1:0,1:1,2:1,4:1比例混合,在CD3抗體與CD28抗體聯(lián)合作用下,刺激7天后進行流式檢測,發(fā)現(xiàn)擴增后的CD4+CD25+T細胞可以有效的抑制CD4+CD25-T細胞的增殖;
4.用C
15、D4、CD25和FOXP3這個三個標志,對擴增后細胞進行流式細胞分選,最終我們得到了2×106個純度為99%的CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞以及1×107個純度為99.4%的CD4+CD25+FOXP3-T細胞,我們將其分別命名為Treg細胞和活化的普通T細胞(active conventional T cells,aTconv)。
第二部分:H3K4me3在人Treg細胞基因表達調控中作用
1.高通量測
16、序前通過對已知位點的QPCR檢測,結果顯示:已知基因的啟動子區(qū)域,在Treg細胞和aTconv細胞中都會被H3K4me3高度修飾,而在陰性對照組IgG中,幾乎不發(fā)生H3K4me3的富集;但是FOXP3基因的啟動子區(qū)域例外,結果顯示僅僅Treg細胞中會發(fā)生強烈的H3K4me3修飾,在aTconv細胞和陰性對照組中,沒有富集。這些結果與理論是一致的,從而保證了樣品的可靠性;
2.ChIP樣品送往深圳華大基因研究所進行高通量測序,經
17、過生物信息學分析,得到了Treg細胞和aTconv細胞H3K4me3的全基因組圖譜;
3.運用生物信息學的方法首先從整體上比較了兩樣品的H3K4me3 peaks,發(fā)現(xiàn):peaks的相關系數(shù)為0.92且共有的peaks數(shù)目為20784;然后比較了兩類細胞之間的H3K4me3 proximal promoters,發(fā)現(xiàn)promoters的相關系數(shù)為0.83且有15508個共有的proximal promoters;最后比較了H3
18、K4me3 proximal promoters相關基因,發(fā)現(xiàn)絕大部分的基因是共有基因,只有1220個Treg細胞特異性的基因,這其中就包括Treg細胞特異性的轉錄因子FOXP3;
4.選取了與Treg細胞功能密切相關的基因,例如FOXP3,IL2RA,CTLA,腫瘤壞死因子受體超家族成員18(tumor necrosis factor receptor superfamily member18,TNFRSF18),STAT家
19、族和CCR7,通過UCSC Genome Browser圖形化展示,發(fā)現(xiàn):IL2RA,CTLA4,TNFRSF18和STATs這些基因的啟動子區(qū)域,不管是在Treg細胞還是aTconv細胞,都發(fā)生了比較強烈的H3K4me3修飾。但是FOXP3和CCR7基因啟動子區(qū)域,只有在Treg細胞才發(fā)生了強烈的H3K4me3修飾,而在aTconv細胞中卻沒有;mRNA的表達水平與H3K4me3在啟動子區(qū)域的修飾程度一致。
第三部分:H3K
20、4me1在人Treg細胞基因表達調控中的作用
1.高通量測序后通過對已知位點的QPCR檢測,結果顯示:在Treg細胞或者aTconv細胞的已知位點,會發(fā)生比較比較強烈的H3K4me1富集,但在陰性對照組中,則幾乎不發(fā)生H3K4me1的富集,驗證了數(shù)據的準確性;
2.ChIP樣品送往深圳華大基因研究所進行高通量測序,經過生物信息學分析,得到了Treg細胞和aTconv細胞H3K4me1的全基因組圖譜;
3.運
21、用生物信息學的方法首先從整體上比較了兩樣品的H3K4me1 peaks,發(fā)現(xiàn):peaks的相關系數(shù)為0.48且在總共115391個H3K4me1 peaks中只有8897個共有的peaks;
4.選取了與Treg細胞功能密切相關的基因,例如FOXP3,IL2RA,CTLA及TNFRSF18,通過UCSC Genome Browser圖形化展示發(fā)現(xiàn),發(fā)現(xiàn):Treg細胞和aTconv細胞之間,這些基因座上的H3K4me1修飾是差別
22、明顯的,但也存在少許的共有H3K4me1位點;
5.雙熒光素酶報告基因實驗對H3K4me1位點進行功能鑒定,發(fā)現(xiàn)5個候選的H3K4me1位點中,只有2個在Jurkat細胞中有增強子的活性,而另外3個則沒有明顯的增強子活性;同時也發(fā)現(xiàn),有2個Treg細胞和aTconv細胞共有的H3K4me1位點,在Jurkat細胞都顯示了明顯的增強子活性;
6.通過生物信息學比較,發(fā)現(xiàn):Treg細胞和aTconv細胞中,H3K4me1
23、 peaks和H3K4me3 peaks的相關性分別為0.16和0.19;同時還發(fā)發(fā)現(xiàn),在Treg細胞中,僅僅有5030個位點是同時被H3K4me1和H3K4me3修飾,而在aTconv細胞中,也僅僅有7063個位點被同時修飾。
結論:
1.本研究采用MACS+FACS的方法得到了足夠數(shù)量并且極高純度的Treg細胞和aTconv細胞,從而為下一步實驗奠定了非常堅實的基礎,也為關于Treg細胞的其他方面研究建立了一個非
24、常好的平臺;
2.我們首次繪制并比較了Treg細胞和aTconv細胞H3K4me3修飾的全基因組圖譜,發(fā)現(xiàn)這兩類細胞間H3K4me3修飾,特別是位于近端啟動子區(qū)域的H3K4me3修飾,變化不大;但是在某些Treg細胞特異性或者高表達的基因(例如FOXP3和CCR7)的啟動子上,H3K4me3修飾卻只發(fā)生在Treg細胞上。QPCR結果顯示mRNA的表達水平與H3K4m3在啟動子上的修飾程度一致。這些結果提示我們:表觀遺傳可能通過
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