香煙煙霧致BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中相關(guān)基因表達(dá)及啟動子甲基化改變.pdf

1、目的:建立香煙煙霧致體外人支氣管上皮細(xì)胞惡性改變的細(xì)胞模型,研究香煙煙霧染毒誘發(fā)人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)惡性轉(zhuǎn)化中相關(guān)基因表達(dá)情況和RASSF1A、MGMT、p16、APC、DAPK-1等基因啟動子甲基化狀況,探索吸煙致肺癌發(fā)生機(jī)制,為吸煙致肺癌防治提供理論依據(jù)。
　　 方法:將處于對數(shù)生長期的:BEAS-2B細(xì)胞以1×105接種于Transwell培養(yǎng)皿中,細(xì)胞貼壁后將Transwell培養(yǎng)皿置于細(xì)胞氣體染毒裝置中染

2、毒,培養(yǎng)基霧化泵入維持細(xì)胞生存環(huán)境,氧氣濃度恒定于21％,水浴維持染毒腔溫度在37℃。CCK-8法檢測染煙后細(xì)胞增殖抑制率確定染煙濃度及時間,獲得合適染毒濃度和染毒時間后進(jìn)行正式染毒。染煙兩次后將Transwell培養(yǎng)皿中細(xì)胞消化下置于培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng),待生長至對數(shù)生長期后進(jìn)行下一代染煙,共染煙40代。對照組暴露于煙霧濃度為0％的相同裝置中,其余條件同染煙組。比較對照組細(xì)胞、染煙5代、10代、15代、20代、25代、30代、35代、40

3、代細(xì)胞的一般生物學(xué)狀況(生長狀況、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率),血清抗性實(shí)驗(yàn)、錨著獨(dú)立性生長實(shí)驗(yàn)等細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化指標(biāo)。對照組和各染毒組細(xì)胞再各傳至20代時RT-PCR.后檢測各組p16、Survivin和bcl-2基因mRNA的表達(dá)水平。以甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測處于惡性轉(zhuǎn)化各階段中RASSF1A、MGMT、p16、DAPK-1、APC基因啟動子特異位點(diǎn)的甲基化狀況；同時檢測RASSF1A、MGMT基因mRNA表達(dá)情況。

4、
　　 結(jié)果:(1)細(xì)胞染煙模型的建立。在染煙時間相同條件下,隨染煙濃度升高,細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加；在煙霧濃度相同條件下,隨染毒時間延長,細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加,最后確定染毒濃度和時間為20％,10min。隨染煙代數(shù)的增加,人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,表現(xiàn)為形態(tài)學(xué)和生長特性變化,細(xì)胞呈現(xiàn)異形性,核質(zhì)比例增大,核仁大而多；細(xì)胞間失去接觸抑制,呈復(fù)層重疊生長,細(xì)胞傳代周期由4d縮短為2d；至染煙40代細(xì)胞融合率可

5、達(dá)100％,而對照組細(xì)胞融合率達(dá)到80％后即出現(xiàn)生長停滯情況。隨染煙代數(shù)的增加,細(xì)胞形態(tài)學(xué)及生長趨于穩(wěn)定,表現(xiàn)出類似癌細(xì)胞的生長特性。各染煙組細(xì)胞G1期百分比明顯減少,增殖指數(shù)明顯升高,表明細(xì)胞處于增殖旺盛狀態(tài),其周期發(fā)生一定程度的失控,同時細(xì)胞凋亡率明顯降低,呈現(xiàn)凋亡抑制狀態(tài)。(2)對細(xì)胞惡性程度的變化分析發(fā)現(xiàn):香煙煙霧染毒至5代時細(xì)胞即已獲得惡性轉(zhuǎn)化,表現(xiàn)為抗血清生長能力增強(qiáng),在含10％血清培養(yǎng)基中細(xì)胞克隆形成率可達(dá)32.34％(P

6、<0.05),同時獲得錨著獨(dú)立生長能力,其克隆形成率可達(dá)8.48％(P<0.05)。至染毒40代細(xì)胞時上述兩項(xiàng)指標(biāo)分別達(dá)到97.11％、89.17％(均P<0.05),表明該細(xì)胞惡性程度已相當(dāng)高。bcl-2基因mRNA在對照組及各染毒組細(xì)胞均未表達(dá)； p16基因mRNA在對照組細(xì)胞中高表達(dá),各染煙組細(xì)胞表達(dá)量圍繞對照組表達(dá)量上下波動,總體呈現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)趨勢； Survivin基因mRNA在對照組細(xì)胞中無表達(dá),隨著染毒代數(shù)的增加均高表達(dá),呈

7、現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。(3)對RASSF1A、MGMT、p16、DAPK-1、APC基因啟動子特異位點(diǎn)的甲基化狀況進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn):對照組細(xì)胞RASSF1A、MGMT基因無甲基化表達(dá),自染煙5代細(xì)胞開始即已開始甲基化表達(dá),至染煙40代細(xì)胞一直穩(wěn)定表達(dá)；對照組細(xì)胞及各染毒代細(xì)胞p16、APC基因均無甲基化表達(dá)；DAPK-1基因在對照組細(xì)胞及各染毒代細(xì)胞均為甲基化表達(dá)。對RASSF1A基因mRNA表達(dá)水平分析后發(fā)現(xiàn):該基因在對照組細(xì)胞中高表達(dá),各染

8、煙組細(xì)胞mRNA表達(dá)水平均顯著降低,并呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系(P<0.01)。MGMT基因在對照組細(xì)胞高表達(dá),染煙后表達(dá)水平均顯著降低,同樣呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.01)。
　　 結(jié)論:1.建立了香煙煙霧誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞模型,獲得了體外染毒的最佳濃度和最佳染毒時間。2.細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生了改變。3.RASSF1A、MGMT基因啟動子區(qū)甲基化和表達(dá)水平降低可能在香煙煙霧誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞惡