miR-138-1-在AFB1誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、環(huán)境致癌物與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其致癌機(jī)制越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注。環(huán)境致癌物可引起機(jī)體某些表觀遺傳學(xué)的改變，在其所致的腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。其中，microRNAs（miRNAs）已被認(rèn)為腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，可通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控許多基因的表達(dá)影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程，促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的進(jìn)展。黃曲霉毒素B1(AFB1)是公認(rèn)的強(qiáng)致癌物，廣泛分布于高濕高熱地區(qū)的各種糧食和飼料中，空氣中的AFB1污染可能與肺

2、癌的發(fā)生有關(guān)。AFB1系間接致癌物，可被呼吸系統(tǒng)中高表達(dá)的細(xì)胞色素P4502A13代謝活化而增強(qiáng)其致癌能力。課題組前期采用0.1 nM AFB1處理高表達(dá)CYP2A13的肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B(B-2A13)50代(P50)可引起惡性轉(zhuǎn)化，但miRNAs在此過(guò)程中的作用及其機(jī)制尚不清楚。因此，了解miRNAs在AFB1致B-2A13細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用及其機(jī)制有助于全面認(rèn)識(shí)miRNAs在環(huán)境致癌物所致腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用

3、。圍繞上述問(wèn)題，本研究利用miRNA芯片比較了P50惡性轉(zhuǎn)化的B-2A13細(xì)胞和同期對(duì)照細(xì)胞的miRNAs表達(dá)譜，篩選與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的關(guān)鍵miRNAs;再通過(guò)功能研究評(píng)價(jià)關(guān)鍵miRNA在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用及其分子調(diào)控機(jī)制;試圖為闡明環(huán)境致癌物AFB1與肺癌的關(guān)系提供依據(jù)，也為肺癌的預(yù)防和控制提供新的生物學(xué)標(biāo)志。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：AFB1誘導(dǎo)的B-2A13細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的關(guān)鍵miRNAs的篩選。
　　

4、目的：篩選在P50 B-2A13細(xì)胞和P50 B-Vector細(xì)胞間差異表達(dá)的miRNAs，尋找與AFB1所致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的關(guān)鍵miRNAs。
　　方法：采用Affymetrix miRNA芯片中檢測(cè)AFB1持續(xù)處理的惡性轉(zhuǎn)化的P50B-2A13細(xì)胞和同期未轉(zhuǎn)化的對(duì)照細(xì)胞(P50 B-Vector)的miRNAs表達(dá)譜，比較兩種細(xì)胞間差異表達(dá)的miRNAs。采用TargetScan軟件預(yù)測(cè)差異表達(dá)的miRNAs的靶基因，分析它

5、們所參與的基因通路，篩選出與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及肺癌發(fā)生密切相關(guān)的miRNAs，采用RT-qPCR對(duì)相關(guān)miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證。最后再采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNAmimics的方法在P50 B-2A13細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-138-1*、miR-1271、miR-296-3p和miR-708，用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)它們對(duì)P50 B-2A13細(xì)胞增殖和遷移的影響。
　　結(jié)果：⑴Affymetrix miRNA芯片分析:在P50 B-2A13細(xì)

6、胞和P50 B-Vector細(xì)胞間差異表達(dá)的miRNAs有63個(gè)，其中上調(diào)的有36個(gè)，下調(diào)的有27個(gè)。⑵TargetScan軟件預(yù)測(cè):初步篩選出差異表達(dá)的miRNAs共13個(gè)，其中上調(diào)的有7個(gè)，分別為miR-432、miR-382、miR-370、miR-335、miR-183、miR-494和miR-421;下調(diào)的有6個(gè)，分別為miR-138、miR-138-1*、miR-708、miR-125b-1*、miR-1271、miR-29

7、6-3p。⑶RT-qPCR驗(yàn)證:RT-qPCR和芯片結(jié)果高度相關(guān)，除miR-370、miR-138、miR-494外，其余10個(gè)miRNAs的表達(dá)改變同芯片結(jié)果方向一致。⑷細(xì)胞增殖:與對(duì)照組(miR-Control)相比，miR-138-1*可抑制P50B-2A13細(xì)胞的增殖，但miR-1271、miR-296-3p和miR-708對(duì)P50 B-2A13細(xì)胞的增殖影響不顯著。⑸細(xì)胞遷移:測(cè)定的4種miRNAs都能抑制細(xì)胞的遷移，其中mi

8、R-138-1* mimics處理組的抑制作用最為顯著。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-Control、miR-138-1*、miR-1271、miR-296-3p和miR-708的P50 B-2A13細(xì)胞的24 h劃痕愈合情況分別為47％、27％、30％、37％和32％。
　　第二部分：miR-138-1*對(duì) AFB1所致的B-2A13細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響及調(diào)控機(jī)制。
　　目的：探討miR-138-1*對(duì)AFB1所致的B-2A13細(xì)胞的惡性

9、轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響，分析miR-138-1*調(diào)控的分子機(jī)制。
　　方法：采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法改變miR-138-1*或PDK1在P50 B-2A13細(xì)胞的表達(dá)水平。用體外研究評(píng)價(jià)miR-138-1*或PDK1對(duì)P50 B-2A13細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和克隆形成的影響。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、Western blot、RT-qPCR、報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等

10、按標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行。
　　結(jié)果：⑴miR-138-1*對(duì)P50 B-2A13細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和克隆形成的影響:增加miR-138-1*的表達(dá)能顯著抑制P50 B-2A13細(xì)胞的增殖、劃痕愈合、克隆形成、遷移和侵襲。⑵miR-138-1*調(diào)控的關(guān)鍵靶基因篩選:用RNA22-HAS、MICRORNA.ORG和DIANA-MICROT等軟件對(duì)miR-138-1*的靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果以及RT-qPCR、Western blot和雙熒光素

11、酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)皆顯示，PDK1可能是miR-138-1*影響P50 B-2A13細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和克隆形成的調(diào)控靶基因，miR-138-1*對(duì)PDK1的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)都具有明顯的抑制作用。⑶PDK1對(duì)miR-138-1*表達(dá)水平的影響:RT-qPCR檢測(cè)顯示，siRNA介導(dǎo)的PDK1在P50 B-2A13細(xì)胞的敲除不影響miR-138-1*的表達(dá)。⑷miR-138-1*對(duì)PI3 K/PDK1/Akt信號(hào)通路的調(diào)控:與

12、P0 B-2A13細(xì)胞、P50 B-vector細(xì)胞和BEAS-2B細(xì)胞相比，p-PDK1、p-Akt和p-GSK-3β的表達(dá)水平在P50 B-2A13細(xì)胞明顯增強(qiáng)，同樣，在過(guò)表達(dá)miR-138-1*的P50 B-2A13細(xì)胞，p-PDK1、p-Akt和p-GSK-3β的表達(dá)水平也有減少。⑸PDK1對(duì)P50 B-2A13細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和克隆形成的影響:在P50 B-2A13細(xì)胞中敲減PDK1的表達(dá)能明顯抑制細(xì)胞的增殖、劃痕愈合、克

13、隆形成、遷移和侵襲。
　　結(jié)論：①通過(guò)miRNAs芯片和初步的功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了63個(gè)miRNAs與AFB1誘導(dǎo)的B-2A13細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，由于miR-138-1*能顯著抑制P50 B-2A13細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和克隆形成，可能是起關(guān)鍵作用的miRNA。②miR-138-1*可以顯著抑制P50 B-2A13細(xì)胞PDK1的表達(dá)，PDK1是miR-138-1*的靶基因之一。③PDK1介導(dǎo)的PI3K/PDK1/Akt信號(hào)通路在惡