雷公藤紅素對(duì)NETs相關(guān)因子的劑量效應(yīng)及一種新吞噬功能檢測(cè)法初探.pdf

1、目的:
　　觀察雷公藤紅素對(duì)人中性粒細(xì)胞mTOR mRNA的表達(dá)及組蛋白H3釋放的影響，并探討、分析兩者間關(guān)系，探討雷公藤紅素對(duì)中性粒細(xì)胞組蛋白H3釋放可能存在的劑量效應(yīng)，及其對(duì)中性粒細(xì)胞抗感染功能影響，進(jìn)而為雷公藤在臨床運(yùn)用上提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和理論依據(jù)。建立一種新的評(píng)價(jià)中性粒細(xì)胞吞噬功能的流式細(xì)胞儀-石墨烯量子點(diǎn)方法，經(jīng)過優(yōu)化將其初步運(yùn)用于評(píng)價(jià)健康人和腫瘤化療后患者中性粒細(xì)胞吞噬功能。
　　方法:
　　1.雷公藤紅素

2、對(duì)中性粒細(xì)胞mTOR表達(dá)及組蛋白H3釋放的影響
　　分離健康人外周血中性粒細(xì)胞，短暫培養(yǎng)。雷公藤紅素分別按低劑量、中劑量、高劑量三組各干預(yù)中性粒細(xì)胞1h、1.5h、2h，運(yùn)用Real-time PCR檢測(cè)mTOR mRNA表達(dá)，同時(shí)平行采用激光共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)中性粒細(xì)胞組蛋白H3的釋放情況，并分析兩者間關(guān)系。
　　2.一種新型熒光材料GQDs評(píng)價(jià)中性粒細(xì)胞吞噬功能的流式細(xì)胞術(shù)方法初探
　　應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察中性

3、粒細(xì)胞吞噬石墨烯量子點(diǎn)情況，進(jìn)而采用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察被吞入中性粒細(xì)胞內(nèi)的石墨烯量子點(diǎn)的熒光特性。對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)使用QuantiBRITE PE標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)κ┝孔狱c(diǎn)熒光強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，建立一種新的評(píng)價(jià)中性粒細(xì)胞吞噬功能的流式細(xì)胞儀-氧化石墨烯量子點(diǎn)方法;并將此法用于評(píng)價(jià)健康成人和腫瘤化療后患者中性粒細(xì)胞的吞噬功能，初步驗(yàn)證其可行性。
　　結(jié)果:
　　1.雷公藤紅素對(duì)中性粒細(xì)胞mTOR mRNA表達(dá)的劑量

4、效應(yīng)
　　實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，雷公藤紅素在低濃度短時(shí)間內(nèi)可誘導(dǎo)mTOR mRNA表達(dá)增加，但隨著干預(yù)濃度及時(shí)間的延長，mTOR mRNA的表達(dá)受到顯著的抑制。
　　2.雷公藤紅素對(duì)佛波酯刺激中性粒細(xì)胞釋放組蛋白H3的劑量效應(yīng)
　　低濃度雷公藤紅素在短時(shí)間內(nèi)能夠抑制佛波酯刺激中性粒細(xì)胞釋放組蛋白H3，高濃度能促進(jìn)佛波酯刺激中性粒細(xì)胞釋放組蛋白H3。雷公藤干預(yù)中性粒細(xì)胞1小時(shí)后，在佛波酯的刺激下，高濃度組(4.0μM)比對(duì)照

5、組(0.0μM)能夠釋放更多量的組蛋白H3，而低濃度(1.0μM)干預(yù)1小時(shí)時(shí)，在佛波酯的刺激下未能釋放組蛋白H3。
　　3.透射電子顯微鏡觀察顯示石墨烯量子點(diǎn)被大量吞入中性粒細(xì)胞胞內(nèi)，在中性粒細(xì)胞的吞噬囊泡和偽足內(nèi)可見密集的石墨烯量子點(diǎn)，與空白對(duì)照比較，無非特異性吸附。
　　4.激光共聚焦熒光顯微鏡觀察顯示被吞入中性粒細(xì)胞胞內(nèi)的石墨烯量子點(diǎn)在同一激發(fā)光激發(fā)下發(fā)射不同波長熒光，當(dāng)發(fā)射波長為408nm呈現(xiàn)明顯藍(lán)色，發(fā)射波長為4

6、88nm呈現(xiàn)明顯綠色。
　　5.初步建立一種新的評(píng)價(jià)中性粒細(xì)胞吞噬功能的流式細(xì)胞儀-石墨烯量子點(diǎn)方法
　　初步確定實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件:200μl的全血，加入10μl脂多糖(LPS100ng/ml)，12μlGQDs，37℃水浴反應(yīng)30min。使用QuantiBRITE PE標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)κ┝孔狱c(diǎn)熒光強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理;并將本方法用于評(píng)價(jià)健康成人和腫瘤化療后患者中性粒細(xì)胞的吞噬功能，結(jié)果顯示該法能明顯區(qū)分化療組患者和健康組的中性粒細(xì)