鹽藻絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶基因DsSTPK的克隆和表達分析.pdf

1、鹽藻(Dunaliella salina)是一種低等單細胞真核生物,屬于綠藻門、真綠藻綱、團藻目、鹽藻科、鹽藻屬,是已知最為耐鹽的真核生物之一,是研究植物高鹽適應的模式生物。多年以來許多學者從鹽藻適應高鹽環(huán)境的滲透調(diào)節(jié)、耐鹽相關(guān)基因的克隆及鹽藻質(zhì)膜、胞漿蛋白質(zhì)組等方面進行了研究,取得了一定的進展。但到目前為止對其耐鹽的分子機制和信號轉(zhuǎn)導途徑仍不清楚。
　　蛋白磷酸化是調(diào)節(jié)細胞對各種外界信號應答的重要調(diào)節(jié)機制。蛋白激酶通過對底物蛋白

2、的磷酸化參與細胞信號轉(zhuǎn)導,是細胞信號轉(zhuǎn)導過程中起重要作用的信號分子。由特定的蛋白激酶催化的特定蛋白磷酸化調(diào)控著細胞的基本進程,如細胞周期調(diào)控、細胞的生長發(fā)育、分裂分化調(diào)控、基因表達調(diào)控等。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine-threonine protein kinase, STPK)是最重要的一類蛋白激酶,通過催化多種功能蛋白(如酶、受體、運輸?shù)鞍?、調(diào)節(jié)蛋白、核內(nèi)蛋白等)的磷酸化,從而調(diào)節(jié)細胞多種生命活動過程。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶

3、的研究對于闡明耐鹽的分子機制具有重要科學意義。因此,本研究克隆了鹽藻絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因,并對其進行了生物信息學分析和表達的研究。主要的實驗方法和結(jié)論如下:
　　1.通過RT-PCR和RACE技術(shù)成功地克隆了鹽藻一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因(GenBank Accession No.JN625213),命名為DsSTPK。DsSTPK基因的cDNA全長為3129bp,其中5′UTR為242bp,3′UTR為703bp,開放

4、閱讀框為2184bp,編碼727個氨基酸。
　　2.生物信息學分析表明:該蛋白為不具有跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽的親水性蛋白,定位于細胞質(zhì)基質(zhì);DsSTPK存在兩個保守區(qū)域(167-175位一個蛋白激酶的ATP結(jié)合區(qū)、293-305位一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性區(qū)),并且存在多個潛在的磷酸化位點;二級結(jié)構(gòu)的主要元件為無規(guī)卷曲和α-螺旋,催化區(qū)在三維結(jié)構(gòu)上形成一個活性空腔;氨基酸序列同衣藻絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(XP_001701465.1

5、)有最高的相似性(65%),進化分析表明,DsSTPK與衣藻和團藻的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶親緣關(guān)系最近;活性分析顯示,DsSTPK與激活物磷脂酰絲氨酸(PS)、二酰甘油(DAG)、佛波酯(TPA)的結(jié)合能較低,結(jié)合較穩(wěn)定,并且催化組蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化。
　　3.利用實時熒光定量PCR法檢測了其在高鹽(3M)脅迫下表達量的變化情況,結(jié)果表明:鹽藻在高鹽(3M)脅迫下DsSTPK的表達量明顯升高,且脅迫12 h時表達量達到

6、最高,為在正常生長狀況下(1.5M)鹽藻中表達量的2.3倍,差異達到顯著水平(P<0.05)。隨著脅迫時間的延長DsSTPK的表達量逐漸降低,并恢復到正常水平。
　　4.利用DNA重組技術(shù)將DsSTPK的開放閱讀框與質(zhì)粒pET32a(+)相連,構(gòu)建成原核表達載體pET32a(+)-DsSTPK,再將原核表達載體導入E.coli.BL21(DE3)中,通過IPTG誘導表達,融合蛋白在上清和包涵體中均存在,將上清蛋白純化后獲得了純度較