水稻GUN4基因的克隆與功能分析.pdf

1、基因組解偶聯(lián)基因4(GENOMES UNCOUPLED4，GUN4)最先在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，不僅通過激活鎂螯合酶活性從而促進(jìn)葉綠素合成，而且可能參與質(zhì)體→核反向信號(hào)途徑的調(diào)控，但其具體機(jī)理尚不清楚。本研究中，我們以一個(gè)水稻葉綠素缺陷型的黃葉突變體黃玉B(HYB)為材料，利用圖位克隆，鑒定到一個(gè)GUN4的水稻同源基因OsGUN4，并確定該黃葉特征是由一個(gè)表觀遺傳突變等位基因epi-GUN4所控制。HYB的核苷酸序列與野生型親本的完全一致，但在

2、其啟動(dòng)子中的一個(gè)抗氧化應(yīng)答元件(antioxidant response element，ARE)的甲基化水平增加;去甲基化處理可部分恢復(fù)epi-GUN4的功能，使黃葉型幼苗回復(fù)正常綠色。在此基礎(chǔ)上，我們確定了OsGUN4的亞細(xì)胞定位，分析了OsGUN4對(duì)弱強(qiáng)光轉(zhuǎn)換和H2O2脅迫下的響應(yīng)途徑。主要結(jié)果如下:
　　HYB具有光照強(qiáng)度敏感性。田間條件下，HYB在整個(gè)發(fā)育期內(nèi)表現(xiàn)穩(wěn)定的黃葉表型，其葉綠素含量?jī)H為野生型親本龍?zhí)仄諦(LTB

3、)的15.0％。該突變表型對(duì)環(huán)境條件敏感，特別是光照強(qiáng)度。在弱光條件下，HYB植株表現(xiàn)淡綠葉色，葉綠素含量約為L(zhǎng)TB植株的33％;經(jīng)強(qiáng)光下培養(yǎng)10天后，突變體葉色呈現(xiàn)黃色，其葉綠素含量?jī)H為L(zhǎng)TB植株的5％。
　　OsGUN4是HYB黃葉突變性狀的候選基因。為了揭示控制黃葉突變性狀的分子機(jī)理，采用圖位克隆法，利用來自于HYB和其他3個(gè)野生型(wild-type)品種雜交所構(gòu)建的3173個(gè)F2黃葉隱性單株個(gè)體，在先前定位的基礎(chǔ)上，進(jìn)一

4、步將該黃葉突變位點(diǎn)(xantha，XNT)定位于第11號(hào)染色體短臂上約57kb區(qū)間內(nèi)，位于分子標(biāo)記IDS7和SNP18之間。該區(qū)段共有8個(gè)預(yù)測(cè)的開放編碼閱讀框（openreading frames，ORFs），其中ORF2(Os11g1267000)預(yù)測(cè)編碼OsGUN4蛋白。但是，對(duì)定位區(qū)段的測(cè)序結(jié)果表明，HYB與LTB之間的核苷酸序列并無差異。為此，進(jìn)一步對(duì)8個(gè)ORFs做了qRT-PCR表達(dá)分析。盡管ORF2在LTB植株葉片中高度表達(dá)

5、，但在HYB突變體植株中幾乎檢測(cè)不到OsGUN4轉(zhuǎn)錄物，而其他7個(gè)ORFs的表達(dá)則在LTB與HYB之間無顯著差異。
　　HYB的黃葉突變位點(diǎn)是OsGUN4基因的等位突變位點(diǎn)。為了證實(shí)可能是OsGUN4基因的突變導(dǎo)致了黃葉表型，將HYB與經(jīng)伽瑪射線誘變處理的一個(gè)溫敏雄性不育水稻GS113的M2群體雜交，從約30000個(gè)M3F1穗行中選育得到4個(gè)出現(xiàn)黃葉幼苗的穗行。為了確定這些黃苗是否由OsGUN4基因突變引起，對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)

6、現(xiàn)黃葉幼苗存在3種缺失突變（其中2個(gè)穗行的突變一致），并定名為gun4-1～gun4-3。這些結(jié)果表明，HYB的黃葉突變是OsGUN4基因的等位突變位點(diǎn)。
　　黃葉突變是由OsGUN4的表觀遺傳突變引起。利用硫化測(cè)序法對(duì)HYB突變體中OsGUN4基因及其上下游序列進(jìn)行了甲基化分析，發(fā)現(xiàn)OsGUN4的啟動(dòng)子區(qū)域-2386 bp處有一個(gè)甲基化發(fā)生變化的位點(diǎn)，并且該位點(diǎn)恰好處于抗氧化應(yīng)答元件(antioxidant response e

7、lement，ARE)上。利用去甲基化試劑5-氮嘧啶-2'雜（5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-dC）處理HYB及其黃葉衍生系會(huì)有28.0-56.0％的幼苗葉色恢復(fù)正常綠色，從而進(jìn)一步確定了HYB的黃葉突變是一個(gè)OsGUN4的表觀遺傳等位突變，記為epi-GUN4。
　　OsGUN4的表達(dá)受ROS的間接誘導(dǎo)。OsGUN4基因僅含一個(gè)外顯子，cDNA全長(zhǎng)1071 bp，編碼273個(gè)氨基酸，具有143個(gè)氨基酸（

8、第87-229個(gè)）組成的GUN4蛋白特有的類GUN4結(jié)構(gòu)域。利用除草劑氟草敏(Norflurazon，NF)處理幼苗后，LTB中與光合作用活性相關(guān)的基因LHCB、PsaA的表達(dá)水平顯著降低，而HYB中LHCB、PsaA仍可維持較高的表達(dá)水平，表明epi-GUN4具有基因組解偶聯(lián)(Genomes Uncoupled，GUN)類基因所具有的典型特征，即其突變或下調(diào)表達(dá)并不會(huì)導(dǎo)致光合作用相關(guān)基因表達(dá)的下降。此外，H2O2和強(qiáng)光處理后，LTB中

9、OsGUN4的表達(dá)量均有顯著上升，而HYB中則保持不變，可見ARE元件是ROS誘導(dǎo)OsGUN4表達(dá)所必需的。放線菌酮(Cycloheximide，CHX)、放線菌酮和H2O2共處理LTB幼苗后，OsGUN4的相對(duì)表達(dá)量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于H2O2單獨(dú)處理時(shí)的表達(dá)量，并且二者OsGUN4的表達(dá)具有類似的變化趨勢(shì)，表明OsGUN4的表達(dá)受ROS的間接誘導(dǎo)。利用亞細(xì)胞定位的方法確定了水稻GUN4蛋白是一個(gè)定位于葉綠體的蛋白。在恒光恒溫(16 h850μ

10、mol m-2 s-1/8 h暗培養(yǎng)，30℃)條件下，采用qRT-PCR方法分析表明，OsGUN4在粳稻品種日本晴和秈稻品種LTB中的表達(dá)具有光周期節(jié)律性。
　　OsGUN4突變會(huì)反饋影響許多核基因的表達(dá)。弱光下HYB植株合成的葉綠素幾乎與LTB相仿，表明水稻GUN4蛋白并非葉綠素合成所必需的，但其在ROS誘導(dǎo)的質(zhì)體→核反向信號(hào)調(diào)控的抗氧化基因表達(dá)中可能起著重要作用。強(qiáng)光和H2O2的脅迫可激活Nrf2-ARE/Keap1抗氧化系統(tǒng)

11、的應(yīng)答，而在HYB中該系統(tǒng)未被充分激活。我們也證實(shí)Nrf2和Keap1的表達(dá)受ROS的間接誘導(dǎo)。此外，還分析了OsGUN4突變對(duì)抗氧化基因表達(dá)影響，發(fā)現(xiàn)HYB突變體中NodL、OCT3、BAP1、OCT3、FER2和WRKY等基因的表達(dá)變化（下降）較大，TRFL4、APX1相對(duì)較小，而DREB2A則基本不變。為闡述OsGUN4在質(zhì)體→核反向信號(hào)途徑中的作用，我們提出了一個(gè)初步的假說。
　　綜上所述，OsGUN4啟動(dòng)子區(qū)域的ARE元

12、件不僅是OsGUN4正常表達(dá)所必需的，而且對(duì)于OsGUN4在氧化脅迫應(yīng)答中發(fā)揮正常功能是重要的。水稻GUN4蛋白可能發(fā)揮多種功能，在強(qiáng)光脅迫下可能主要參與清除來自于O2分解而產(chǎn)生的ROS，而弱光下則促進(jìn)葉綠素的合成。此外，HYB也是一個(gè)水稻中具有獨(dú)特特性的表觀遺傳突變體，主要表現(xiàn)為:(1) HYB中DNA甲基化位點(diǎn)恰好位于OsGUN4基因的啟動(dòng)子區(qū)域ARE元件上，表明ARE元件的甲基化抑制了OsGUN4基因的表達(dá);(2) HYB中，Os