水稻葉片蠟質(zhì)基因的圖們克隆與功能分析.pdf

1、從EMS化學(xué)誘變?cè)颇系胤狡贩N麗江新團(tuán)黑谷后代中獲得了穩(wěn)定遺傳的葉片蠟質(zhì)稀少突變體。本研究對(duì)WSL2基因進(jìn)行了精細(xì)定位和功能分析，初步闡明了WSL2基因的生物學(xué)意義。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.蠟質(zhì)稀少突變體相對(duì)野生型，株高變矮，脆稈脆葉。通過兩個(gè)遺傳群體的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該突變體的蠟質(zhì)稀少和脆稈性狀分別受兩對(duì)獨(dú)立的隱性基因控制，是一個(gè)雙突變體。通過和野生型回交，并且后代選擇的方法，獲得了蠟質(zhì)稀少的純合突變體wsl2。

2、利用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)突變體葉片和葉鞘表皮蠟質(zhì)晶體極度減少，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)wsl2的皮層明顯增厚，內(nèi)充無定形結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。葉綠素滲透實(shí)驗(yàn)表明wsl2缺失蠟質(zhì)層后表皮滲透性明顯增強(qiáng)，離體葉片失水率試驗(yàn)表明突變體非氣孔失水率增加，苗期和分蘗期干旱實(shí)驗(yàn)表明wsl2對(duì)干旱極為敏感。GC-MS分析發(fā)現(xiàn)突變體植株的蠟質(zhì)含量相對(duì)野生型顯著降低，其中C22-C32脂肪酸，C28-C34醛，26-C32醇類和C23-C33鏈烷烴的減少均極顯著，表明突變的基

3、因可能參與了脂肪酸鏈的延伸。利用“突變體×南京11”的F2定位群體，分別定位了蠟質(zhì)基因WSL2和脆稈基因BC(t)。
　　 2.利用“突變體×南京11”的F2群體的2017無蠟質(zhì)性狀的突變單株，將WSL2基因定位于9號(hào)染色體長(zhǎng)臂端30kb區(qū)間內(nèi)，區(qū)間共有4個(gè)預(yù)測(cè)基因。測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)ORF2(Os09g0426800，注釋為WAX2-like蛋白)的第6外顯子與內(nèi)含子之間的剪切位點(diǎn)由GT突變成AT，突變體轉(zhuǎn)錄本引入了85bp的第6內(nèi)

4、含子序列，該內(nèi)含子中存在TAA終止密碼子，蛋白質(zhì)翻譯提前終止，造成WSL2功能喪失。
　　 3.利用“突變體×南京11”的F2群體中脆稈性狀的單株對(duì)bc(t)進(jìn)行了初定位，確定BC(t)基因在5號(hào)染色體短臂的3.5Mb-4.5Mb區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間有已發(fā)表的脆稈基因BC10(Os05g0170000)，測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)BC(t)為BC10的等位突變，BC(t)基因第5外顯子有C(AG)到T(AG)突變，造成翻譯提前終止。穗莖節(jié)石蠟切片分

5、析發(fā)現(xiàn)突變體厚壁組織細(xì)胞壁變薄，為脆稈突變體典型特征。
　　 4.通過基因組互補(bǔ)和干擾實(shí)驗(yàn)證實(shí)了WSL2基因就是候選基因。對(duì)轉(zhuǎn)啟動(dòng)子分析載體植株的GUS組織染色分析表明：葉、葉鞘、花中有強(qiáng)的GUS活性，莖也有弱的活性，但在根中沒有活性。該結(jié)果與各組織半定量RT-PCR表達(dá)譜一致。亞細(xì)胞定位的結(jié)果表明：WSL2-GFP融合蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記載體mcherry-KDEL在擬南芥和水稻的原生質(zhì)體中都是共定位的，WSL2為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的蛋白