水稻SNARE蛋白基因的克隆與功能分析.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物。在一些水稻產(chǎn)區(qū)，病原菌、高鹽、干旱等逆境脅迫嚴重影響了水稻的生長和生產(chǎn)，因此闡明植物耐受逆境脅迫的分子機制和改良植物的抗逆性已經(jīng)成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)研究的主要目標(biāo)之一。本論文的主要研究內(nèi)容分為兩個方面：一、從水稻中分離了4個與植物逆境脅迫信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)的SNARE蛋白家族基因，并對它們的功能進行了初步研究；二、采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了水稻抗稻瘟病質(zhì)膜相關(guān)蛋白的誘導(dǎo)表達情況。
　　 真核生物細胞囊泡運輸過程

2、中的膜融合主要是由SNARE蛋白介導(dǎo)的，SNARE蛋白的結(jié)構(gòu)高度保守。研究發(fā)現(xiàn)，植物中的SNARE蛋白促進植物細胞板形成，能與離子通道蛋白相互作用，有利于植物的正常生長發(fā)育，能提高植物的抗病性及參與植物的向重力性作用。本研究從水稻中克隆了水稻中的SNAP25類蛋白基因OsSNAP32，并對其功能進行初步研究。OsSNAP32基因編碼蛋白含有283個氨基酸，在N端和C端分別存在一個Qb-SNARE結(jié)構(gòu)域和一個Qc-SNARE結(jié)構(gòu)域。洋蔥表

3、皮瞬時表達亞細胞定位結(jié)果表明，OsSNAP32基因的編碼蛋白定位于細胞質(zhì)膜上。半定量RT-PCR的結(jié)果表明，該基因的表達受到H2O2、PEG6000、SA、ABA、冷、熱、稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）和白葉枯病菌（Xanthomonas campestris pv.vesicator）這8種脅迫處理的誘導(dǎo)。對T1代轉(zhuǎn)基因植株進行稻瘟病菌接種處理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)正義OsSNAP32基因植株的抗瘟性與對照相比明顯增強，轉(zhuǎn)反義Os

4、SNAP32基因植株的抗瘟性與對照相比無明顯變化。綜上研究結(jié)果表明OsSNAP32基因在水稻各種脅迫應(yīng)答反應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用。
　　 本研究還克隆了Qb-SNARE蛋白家族成員基因OsNPSN11～13，這3個基因的序列同源性為80％-85％，具有相似的基因組結(jié)構(gòu)，均含有10個外顯子和9個內(nèi)含子，分別定位于水稻第6、3和7條染色體上，多重序列比對結(jié)果表明這3個基因與擬南芥的AtNPSN11～13基因的同源性較高，所編碼的蛋白

5、均含有一個Qb-SANRE結(jié)構(gòu)域和一個跨膜結(jié)構(gòu)域。洋蔥表皮瞬時表達亞細胞定位結(jié)果表明，這3個基因均定位于細胞質(zhì)膜上。將OsNPSN11基因構(gòu)建到表達載體pET-30a中進行原核表達，并進一步得到純化蛋白制備多克隆抗體，用該抗體與水稻細胞的不同提取組分進行Western blot，結(jié)果表明該基因的編碼蛋白定位于質(zhì)膜上。
　　 為了研究水稻中OsNPSN11～13這3個基因的功能，我們用半定量RT-PCR的方法分析這3個基因在H2O

6、2、NaCl和PEG6000處理下的表達情況，發(fā)現(xiàn)OsNPSN11～12基因在用H2O2進行處理時表達量均有所增加，而在用NaCl和PEG6000處理時，OsNPSN11～12基因的表達量有所下降，OsNPSN13基因的表達在各種處理情況下變化并不明顯。進一步研究基因的功能，將這3個基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母細胞中，對轉(zhuǎn)基因酵母細胞和對照酵母細胞進行H2O2、NaCl和甘露醇處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是在固體培養(yǎng)基上還是液體培養(yǎng)基上，在用H2O2進行處

7、理時，轉(zhuǎn)基因酵母細胞比對照酵母細胞長勢好，而在用NaCl弄口甘露醇進行處理時，轉(zhuǎn)基因酵母細胞比對照酵母細胞長勢差表現(xiàn)為更加敏感。為進一步研究基因在植物中的功能，將基因轉(zhuǎn)入煙草中，T1代轉(zhuǎn)基因幼苗在1/2MS培養(yǎng)基上進行H2O2、Nacl和甘露醇處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2處理后，轉(zhuǎn)基因煙草比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵蓍L勢好，用NaCl和甘露醇處理后，轉(zhuǎn)基因煙草比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵蓍L勢差。由上可知，OsNPSN11～13可能參與酵母和煙草的抗H2O2脅迫過

8、程，而在NaCl和甘露醇脅迫過程中可能不起作用。
　　 進一步分析OOsNPSN11～13這3個基因在抵御生物脅迫過程中的功能。通過半定量RT-PCR的方法分析了水稻植株在接種白葉枯病菌和稻瘟病菌處理后的表達情況發(fā)現(xiàn)，在白葉枯病菌接種處理后，OsNPSN11～12基因的表達受到誘導(dǎo)，在稻瘟病菌接種處理后，抗病品種黑殼子粳中OsNPSN11～12基因的表達受到誘導(dǎo)，感病品種蘇御糯中OsNPSN11～12基因的表達在處理前后沒有明顯

9、變化，OsNPSN13基因的表達在兩種病原菌處理前后均沒有明顯變化。鑒于OsNPSN11～12基因在抗稻瘟病品種和感病品種中的表達差異，我們將OsNPSN11基因轉(zhuǎn)化感病品種蘇御糯受體，對T0代轉(zhuǎn)基因植株進行PCR、RT-PCR和Southern blot檢測得到陽性植株后，對T1代轉(zhuǎn)基因植株進行苗期抗瘟性鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)正義OsNPSN11基因植株的抗性明顯增強。以上實驗結(jié)果表明，OsNPSN11基因在水稻植株抗病過程中起著一定的作用

10、，具體的抗病機制有待進一步的實驗證明。
　　 植物質(zhì)膜蛋白在植物抵御病原物侵染早期信號傳導(dǎo)途徑中起著重要的作用。本文采取改進的質(zhì)膜蛋白提取、純化和雙向電泳方法，分析了太湖流域地方抗病品種黑殼子粳在稻瘟病菌菌株北1接種處理前后質(zhì)膜相關(guān)蛋白的誘導(dǎo)表達情況。比較分析了未處理和接種處理8h和24h后質(zhì)膜蛋白的雙向電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)有23個蛋白點受到了不同程度地誘導(dǎo)，并對這23個蛋白點進行了質(zhì)譜鑒定，其中7個蛋白點進行二級串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS

11、）結(jié)果表明這23個誘導(dǎo)表達蛋白可分為四類：1）與植物生長代謝相關(guān)的酶類，如與植物糖酵解相關(guān)的丙糖磷酸異構(gòu)酶（TIM）、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGDH）和3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPD），與脂類代謝相關(guān)的烯酰CoA水合酶（ECH），與能量代謝相關(guān)的蘋果酸脫氫酶（MDH）、乙醇脫氫酶（ADH）、1，4苯醌還原酶（QR）和苯醌氧化還原酶（QR2），與氨基酸代謝相關(guān)的甲酰四氫葉酸合成酶（FTHFS）；2）與植物物質(zhì)合成分解調(diào)節(jié)有關(guān)的蛋白，如