近江牡蠣多糖的純化、結(jié)構(gòu)鑒定、硒化及其生物活性研究.pdf

1、目的:
　　近江牡蠣是我國(guó)南部沿海常見(jiàn)的養(yǎng)殖貝類(lèi)。其殼為中藥材“牡蠣”的來(lái)源之一;其肉品質(zhì)鮮美、富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，且具有多種生物活性;尤其是近江牡蠣多糖具有抗氧化、生精、免疫調(diào)節(jié)等活性。因此如何合理、科學(xué)地開(kāi)發(fā)近江牡蠣資源是一個(gè)有意義的課題。當(dāng)前關(guān)于近江牡蠣多糖的研究報(bào)道雖然不少，但不夠深入。因此本文擬以中醫(yī)理論為依據(jù)，應(yīng)用現(xiàn)代技術(shù)手段，以近江牡蠣肉為原材料，系統(tǒng)研究近江牡蠣多糖分離、純化工藝及其理化性質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行硒化修飾，得到

2、硒化近江牡蠣多糖。研究近江牡蠣多糖體外抗氧化活性及其作用機(jī)制，進(jìn)而研究其對(duì)環(huán)磷酰胺致氧化應(yīng)激小鼠生精能力的影響，探討近江牡蠣多糖改善環(huán)磷酰胺致氧化應(yīng)激小鼠生精活力的作用機(jī)制。為近江牡蠣多糖相關(guān)藥物研究積累資料。為其開(kāi)發(fā)成藥品及相關(guān)功能保健食品奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.近江牡蠣多糖提取、分離及純化
　　采用超聲輔助提取近江牡蠣肉中多糖，將近江牡蠣粗多糖用磁性殼聚糖微球(MCM)吸附去除蛋白質(zhì)，再用DEAE-纖維

3、素52及Sephadex G100柱分離純化粗多糖，得到純化多糖組分。
　　2.近江牡蠣多糖理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)鑒定
　　采用苯酚硫酸法測(cè)定總糖含量，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，BaCl2-明膠法測(cè)定硫酸基含量，烏氏粘度計(jì)法測(cè)定多糖相對(duì)粘度，乙?；磻?yīng)-GC法測(cè)定近江牡蠣多糖的單糖組成，HPLC測(cè)定純度及分子量，UV法測(cè)定吸收情況，F(xiàn)T-IR法測(cè)定官能團(tuán)及糖環(huán)形式，甲基化、GC-MS測(cè)定糖苷鍵連接位點(diǎn)、糖基鏈接次序及分支情況，NM

4、R法測(cè)定異頭碳構(gòu)型、羥基取代情況及糖基鏈接次序，采用剛果紅法測(cè)定糖鏈?zhǔn)欠窬哂腥陕菪Y(jié)構(gòu)。
　　3.近江牡蠣多糖硒化修飾
　　通過(guò)BaCl2-HNO3催化，采用Na2SeO3硒化修飾近江牡蠣多糖，得到其硒化衍生物。
　　4.ORP抑制H2O2誘導(dǎo)TM4細(xì)胞氧化應(yīng)激作用機(jī)制研究
　　以小鼠睪丸Sertoli細(xì)胞（TM4細(xì)胞）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用H2O2建立TM4細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，考察近江牡蠣多糖及其硒化衍生物的抗氧化能

5、力，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western Blot技術(shù)檢測(cè)TM4細(xì)胞中Nrf2基因表達(dá)水平和與其相關(guān)的上游調(diào)控因子及下游目標(biāo)蛋白的影響，來(lái)研究近江牡蠣多糖及其硒化衍生物的抗氧化活性作用機(jī)制。
　　5.ORP抑制環(huán)磷酰胺所致小鼠生殖損傷及其作用機(jī)制
　　將Balb/c小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，建立環(huán)磷酰胺介導(dǎo)的雄性小鼠氧化應(yīng)激模型，考察ORPP及ORPSe對(duì)氧化應(yīng)激小鼠的睪丸組織恢復(fù)能力、精子存活率、畸形精子率，采用實(shí)時(shí)熒光

6、定量PCR及Western Blot技術(shù)檢測(cè)小鼠睪丸中Nrf2基因表達(dá)水平和與其相關(guān)的上游調(diào)控因子及下游目標(biāo)蛋白的影響來(lái)研究ORPP及ORPSe拮抗環(huán)磷酰胺導(dǎo)致生殖損傷的作用機(jī)制。
　　成果:
　　1.近江牡蠣多糖提取、分離及純化
　　(1)通過(guò)超聲輔助提取近江牡蠣臟器中多糖，其得率為9.74±0.55％。近江牡蠣粗多糖中蛋白質(zhì)含量8.62±0.23％。
　　(2)將粗多糖進(jìn)一步用MCM吸附除蛋白，所合成的MCM

7、材料粒徑為2-6μm，最佳除蛋白吸附溫度50℃，吸附反應(yīng)時(shí)間4h。該方法為物理吸附，吸附過(guò)程動(dòng)力學(xué)和吸附等溫線分別可以用拉格朗日準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程及Freundlich方程擬合。此外，根據(jù)吸附方程求得△G及△Ea判斷，MCM吸附是自發(fā)、吸熱的物理吸附反應(yīng)。
　　(3)近江牡蠣粗多糖經(jīng)DEAE-纖維素52柱按極性洗脫后再經(jīng)Sephadex G100篩分后，得到一個(gè)純化組分ORPP，ORPP得率為32.7％。
　　2.近江牡蠣多糖

8、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)鑒定
　　ORPP中總糖含量為88.7％，硫酸基含量為1.2％，蛋白質(zhì)含量0.17％，糖醛酸含量為8.59％，相對(duì)粘度為1.15。其相對(duì)分子質(zhì)量為656kDa。ORPP由葡萄糖構(gòu)成。ORPP具有D-Glc-(1→、→3)-D-Glc-(1→、→4)-D-Glc-(1→及→3，4)-D-Glc-(1→結(jié)構(gòu)，其分支率約為12.7。ORPP無(wú)三股螺旋結(jié)構(gòu)。
　　3.近江牡蠣多糖硒化修飾
　　通過(guò)BaCl2-HN

9、O3催化，采用Na2SeO3硒化修飾近江牡蠣多糖，得到其硒化衍生物ORPSe中Se元素含量為181.9±5.6μg/g。
　　4.近江牡蠣多糖對(duì)TM4細(xì)胞中Nrf2/ARE通路的影響
　　ORPP及ORPSe均可以提高H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激TM4細(xì)胞存活率，且細(xì)胞存活率與給藥劑量相關(guān)。表明ORPP及ORPSe均可以提高TM4細(xì)胞抗氧化能力。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及Western Blot技術(shù)分析，ORPP及ORPSe可能

10、通過(guò)激活Nrf2/ARE通路，增加Nrf2與Keap1解偶聯(lián)使其進(jìn)入胞核，激活A(yù)RE元件，促進(jìn)SOD、HO-1、NQO1等抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶生成，從而提高TM4細(xì)胞抗氧化能力。
　　5.近江牡蠣多糖對(duì)環(huán)磷酰胺介導(dǎo)的雄性小鼠生殖損傷的作用
　　ORPP及ORPSe可能作為誘導(dǎo)物，提高小鼠睪丸組織中Nrf2表達(dá)水平，激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，有助于下游Ⅱ相解毒酶NQO1及抗氧化酶HO-1等目標(biāo)基因表達(dá)，提高機(jī)體對(duì)外界抵抗能

11、力，避免因環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷，緩解雄性小鼠生殖損傷，提高精子數(shù)量、精子存活率，降低畸形精子率。相同劑量下，ORPSe的生精活性顯著優(yōu)于ORPP。
　　結(jié)論:
　　本文以近江牡蠣多糖為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，系統(tǒng)研究其分離、純化工藝，通過(guò)物理及化學(xué)方法研究其理化性質(zhì)，通過(guò)建立H2O2誘導(dǎo)TM4氧化應(yīng)激模型研究其體外抗氧化活性及其作用機(jī)制，建立環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠氧化應(yīng)激模型考察近江牡蠣多糖體內(nèi)生精活性及其作用機(jī)制。發(fā)現(xiàn)MCM材料是一種理

12、想的除粗多糖中蛋白質(zhì)的材料，與酶法、凍融法除蛋白各有優(yōu)勢(shì)，適合用于需要同時(shí)保留活性蛋白及多肽的粗多糖除蛋白;硒化修飾可以將無(wú)機(jī)硒嫁接進(jìn)入多糖中形成有機(jī)硒多糖ORPSe，ORPSe是無(wú)毒物。ORPP及ORPSe體外抗氧化作用機(jī)制應(yīng)該是通過(guò)激活TM4細(xì)胞中Nrf2/ARE信號(hào)通路，促使SOD、HO-1、NQO1等抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶生成，從而提高TM4細(xì)胞抗氧化能力。此外，ORPP及ORPSe可能通過(guò)激活小鼠睪丸Nrf2/ARE信號(hào)通路，提