紫貽貝多糖提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定及其生物活性的初步研究.pdf

1、貽貝是重要的世界性養(yǎng)殖品種,以紫貽貝產(chǎn)量占有最大,并以新鮮貽貝為主要銷售形式,經(jīng)濟效益低。貽貝不但作為傳統(tǒng)的滋補食品,且具有較高的營養(yǎng)價值和多種藥理功效。文獻報道,貽貝及其提取物具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血脂等功能活性。其中,多糖是紫貽貝中的主要活性成分之一,目前對其研究主要集中在紫貽貝粗多糖上,而對紫貽貝多糖組分的提取、分離純化及結(jié)構(gòu)功能研究報道較少。因此,開發(fā)利用紫貽貝多糖具有理論價值和實際意義。本課題以嵊泗枸杞所產(chǎn)紫貽貝為試

2、驗材料,研究了紫貽貝多糖的提取、脫蛋白、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其免疫抗腫瘤活性。主要研究結(jié)果如下:
　　 采用響應(yīng)面方法優(yōu)化紫貽貝多糖的熱水提取工藝。實驗以冷凍干燥后的紫貽貝粉末為原料,研究了浸取溫度、浸取時間及液固比對紫貽貝多糖得率的影響,確定了提取的最佳工藝參數(shù)為:浸提溫度93℃,浸提時間4.2h,液固比44.3:1,在此條件下多糖得率可達19.73％。
　　 對熱水提取醇沉后所得紫貽貝粗多糖MES進行脫蛋白工藝的研究

3、。本實驗采用三種不同方法-Sevag法、酶法和酶法與Sevag聯(lián)用法并比較了對MES的脫蛋白的效果。結(jié)果表明酶法與Sevag聯(lián)用法為最合適的方法,其工藝條件為:酶法:酶種為堿性蛋白酶,最優(yōu)酶解參數(shù):酶量[E]/[S]1.79％,pH9.19,酶解溫度61.79℃；Sevag法:氯仿:正丁醇=4:1(V/V),料液比=3:1(V/V),通過三次脫蛋白處理。
　　 對經(jīng)酶法與Seveg聯(lián)用法脫蛋白后的紫貽貝多糖MES-Ⅰ進行分離純化

4、研究。本實驗先將MES-Ⅰ溶液過0.45μm微孔濾膜抽濾,其后采用10000的超濾膜進行超濾處理。再通過Marco-Prep DEAE離子交換層析和Sephrose4B凝膠柱層析進一步分離純化得到三個組分(MES-Ⅰ-11、MES-Ⅰ-12和。MES-Ⅰ-2)。采用Sephrose6B凝膠過濾層析法、高效液相色譜(HPLC)和醋酸薄膜電泳三種方法對三個組分進行純度分析,確定MES-Ⅰ-11、MES-Ⅰ-12和MES-Ⅰ-2為均一多糖組分

5、。
　　 研究了MES-Ⅰ-11、MES-Ⅰ-12和MES-Ⅰ-2三個均一組分的理化性質(zhì)和初級結(jié)構(gòu)。通過苯酚-硫酸法測定,MES-Ⅰ-11、MES-Ⅰ-12和MES-Ⅰ-2的總糖含量分別為95.2％、91.2％和94.8％。顏色反應(yīng)和紫外光譜(UV)法檢測推斷三個均一組分都不含有蛋白質(zhì)和核酸。HPLC法測定了MES-Ⅰ-11、MES-Ⅰ-12和MES-Ⅰ-2的分子量分別為572.8KD、18.20KD和69.50KD。采用傅里葉

6、紅外光譜(FT-IR)法初步判斷三個組分為糖類化合物,且其多糖結(jié)構(gòu)均含有α-D-葡萄吡喃糖苷鍵。氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)法分析表明MES-Ⅰ-11、MES-Ⅰ-12和MES-Ⅰ-2分別由不同摩爾比的3種單糖-甘露糖、半乳糖和葡萄糖組成。其中,MES-Ⅰ-11的組成成分甘露糖、半乳糖和葡萄糖的摩爾比為2.74:1:18.06；MES-Ⅰ-12的摩爾比為2.2:1:19.44；MES-Ⅰ-2的摩爾比為2.87:1:3.63。核磁共振法(NMR

7、)分析結(jié)果是MES-Ⅰ-11、MlES-Ⅰ-12和MES-Ⅰ-2均有α-D-葡萄糖吡喃糖苷,且在C6上有發(fā)生羥基被取代,主要以α-D-Glc(1→4)-為主要的連接方式。
　　 采用噻唑鹽(MTT)比色法研究MES-Ⅰ-1、MES-Ⅰ-2、MES-Ⅰ-11和MES-Ⅰ-12的免疫活性。結(jié)果表明,在Con A誘導小鼠T淋巴細胞的體外增殖中,各組分均不同程度抑制細胞的增殖反應(yīng)。在高濃度時有明顯抑制作用,顯著性分別為P<0.01、P<

8、0.001、P<0.05、P<0.01。在LPS誘導小鼠B淋巴細胞的體外增殖反應(yīng)中,MES-Ⅰ-1和MES-Ⅰ-12沒有顯著影響,MES-Ⅰ-2在高濃度下呈促進作用(P<0.05),MES-Ⅰ-11在中濃度下也呈促進作用,在低濃度條件下則呈增殖抑制作用(P<0.05)。對K562腫瘤細胞的抗腫瘤活性研究實驗表明,MES-Ⅰ-1、MES-Ⅰ-2、MES-Ⅰ-11和MES-Ⅰ-12在各濃度下均表現(xiàn)出不同程度的抗腫瘤活性,并呈一定的量效關(guān)系,