衰老相關(guān)ATG5缺陷致中性粒細(xì)胞胞外陷阱形成障礙.pdf

1、研究背景:
　　中性粒細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的前沿防線。除經(jīng)典的趨化、調(diào)理、吞噬和清除作用外，中性粒細(xì)胞還存在著另一套極為重要的限制和殺滅病原體的方法，即中性粒細(xì)胞胞外陷阱NETs。NETs是一種復(fù)雜的三維網(wǎng)狀DNA結(jié)構(gòu)，其上附著有多種具有殺傷病原體功能的組分。盡管對(duì)NETs形成機(jī)制、關(guān)鍵環(huán)節(jié)的研究有了很多突破，但對(duì)于還有哪些理化生物因素能夠誘導(dǎo)NETs，以及關(guān)鍵的機(jī)制、分子是否存在共性，仍沒(méi)有一個(gè)確切的答案。老年人群的疾病發(fā)生率和死

2、亡率均遠(yuǎn)高于年輕人群，以感染相關(guān)疾病的情況最為突出，這與免疫衰老密切相關(guān)，即衰老對(duì)免疫系統(tǒng)功能功能的影響。中性粒細(xì)胞作為固有免疫的重要組成部分，衰老使其趨化能力受損、對(duì)細(xì)菌的清除能力減弱、炎癥因子表達(dá)和抗凋亡活性改變。但其對(duì)NETs形成的影響證據(jù)不足、機(jī)制不清。如若衰老影響了中性粒細(xì)胞NETs形成和NETosis過(guò)程，那么是否還會(huì)影響另一種死亡形式，凋亡？衰老導(dǎo)致中性粒細(xì)胞NETosis與凋亡的改變，其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是什么？本研究將著力解

3、決上述三個(gè)問(wèn)題。
　　第一部分 TLR2配體誘導(dǎo)ROS和自噬依賴的NETs形成
　　目的:
　　中性粒細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)的組分之一，其NETosis的過(guò)程及產(chǎn)物NETs，在機(jī)體抵抗病原體感染的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。已經(jīng)明確多種物質(zhì)均可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs，對(duì)于機(jī)體感染/抗感染、炎癥反應(yīng)/抗炎反應(yīng)過(guò)程中的其他分子，能否刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs仍不清楚。本部分研究假設(shè)一:Toll樣受體2(TLR2)配體能夠有效

4、誘導(dǎo)NETs形成。假設(shè)二:TLR2配體誘導(dǎo)的NETs形成為活性氧產(chǎn)物ROS依賴的。假設(shè)三:自噬過(guò)程同樣參與了TLR2配體誘導(dǎo)的NETs形成。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)一:為明確TLR2配體能否誘導(dǎo)NETs形成，提取的野生型WT小鼠原代腹腔中性粒細(xì)胞，體外經(jīng)肽聚糖PGN刺激6h后，confocal下觀察NETs形成。同時(shí)選擇具有代表性的其他TLR2配體:LM、LTA、Pam3CSK4、Pam2CSK4、zymosan，confoc

5、al觀察驗(yàn)證體外誘導(dǎo)NETs形成的能力。進(jìn)一步以6種TLR2配體刺激中性粒細(xì)胞2、3、6h，采用熒光定量法檢測(cè)NETs形成的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)二:為明確TLR2和MyD88在上述配體誘導(dǎo)NETs形成中的作用，采用TLR2 knock-out(KO)小鼠和MyD88 KO小鼠的中性粒細(xì)胞，體外給予PGN刺激6h，經(jīng)confocal觀察NETs形成。進(jìn)一步采用熒光定量法分析上述6種配體體外誘導(dǎo)的WT、TLR2 KO和MyD88 KO小鼠中性粒細(xì)胞N

6、ETs形成是否存在差異。實(shí)驗(yàn)三:為明確TLR2配體與TLR4配體在誘導(dǎo)NETs上是否存在協(xié)同效應(yīng)，采用極小劑量的LPS或PGN體外刺激中性粒細(xì)胞6h后經(jīng)confocal觀察。為進(jìn)一步驗(yàn)證，采用熒光定量法進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)四:為明確NADPH氧化酶依賴的ROS產(chǎn)生是否為TLR2誘導(dǎo)的NETs形成所必需，采用gp91 KO小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)gp91 KO和WT小鼠中性粒細(xì)胞胞內(nèi)ROS的基礎(chǔ)和PGN刺激后水平。進(jìn)而使用定量檢測(cè)分析

7、比較gp91 KO和WT小鼠中性粒細(xì)胞TLR2配體誘導(dǎo)的NETs形成。進(jìn)一步經(jīng)Confocal觀察TLR2配體刺激的gp91 KO小鼠中性粒細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)五:為明確自噬過(guò)程是否參與TLR2配體誘導(dǎo)的NETs形成，同時(shí)給予雷帕霉素和PGN6 h同單獨(dú)給予PGN后經(jīng)confocal觀察NETs形成。
　　結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)一:與對(duì)照相比，PGN能夠誘導(dǎo)典型的NETs結(jié)構(gòu)。同時(shí)，選擇的另外5種TLR2配體也均能夠刺激中性粒細(xì)胞形成NET

8、s。相比于對(duì)照組，6種配體均可顯著提高培養(yǎng)上清液的熒光強(qiáng)度，提示NETs的形成增加。實(shí)驗(yàn)二:經(jīng)confocal觀察，PGN不能顯著誘導(dǎo)TLR2 KO和MyD88 KO小鼠中性粒細(xì)胞的NETs形成。定量分析TLR2 KO和MyD88 KO小鼠中性粒細(xì)胞的NETs形成均低于WT型小鼠。實(shí)驗(yàn)三:極小劑量LPS和PGN均不能顯著誘導(dǎo)NETs形成，而兩者聯(lián)合應(yīng)用則可以明顯增加NETs形成。定量分析得到類似的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)四:gp91KO小鼠中性粒細(xì)胞

9、胞內(nèi)ROS的基礎(chǔ)與WT小鼠無(wú)差異，在PGN刺激后則低于WT小鼠。多種TLR2配體刺激誘導(dǎo)的NETs形成均低于WT小鼠中性粒細(xì)胞。Confocal觀察處理6h后也均未見顯著的NETs形成。實(shí)驗(yàn)五:confocal觀察并計(jì)數(shù)結(jié)果表明PGN加入雷帕霉素相比于單獨(dú)使用PGN，進(jìn)一步提高了NETs的生成。
　　結(jié)論:
　　多種TLR2配體可以有效誘導(dǎo)NETs形成;TLR2-MyD88通路為該過(guò)程所必需;TLR2配體和TLR4配體在誘導(dǎo)

10、NETs形成上具有協(xié)同效應(yīng);NADPH氧化酶產(chǎn)生的ROS為TLR2配體誘導(dǎo)的NETs形成所必需;且自噬也參與該過(guò)程。
　　第二部分老年小鼠中性粒細(xì)胞NETs形成障礙及其機(jī)制
　　目的:
　　免疫衰老，即衰老引起的免疫系統(tǒng)功能減退，影響著固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的方方面面。中性粒細(xì)胞功能的改變直接影響著老年個(gè)體對(duì)病原體的防御能力。衰老使得中性粒細(xì)胞趨化能力受損、對(duì)病原體的吞噬及清除能力降低、ROS的產(chǎn)生受到影響、抗凋亡能

11、力發(fā)生改變、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常等。但對(duì)于老年個(gè)體NETs形成的影響證據(jù)較少，機(jī)制不清。本部分研究假設(shè)一:老年小鼠中性粒細(xì)胞NETs形成存在障礙，弱于年輕小鼠。假設(shè)二:老年和年輕小鼠中性粒細(xì)胞自噬活性的差異是NETs形成障礙的原因。假設(shè)三:ATG5是老年小鼠中性粒細(xì)胞TLR信號(hào)誘導(dǎo)的自噬活性缺陷的關(guān)鍵分子。假設(shè)四:老年小鼠中性粒細(xì)胞NETs形成障礙還存在其他機(jī)制，如趨化能力減弱，ROS產(chǎn)生減少。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)一:為明確老年和

12、年輕小鼠中性粒細(xì)胞體內(nèi)NETs形成能力是否存在差異，取年輕和老年小鼠構(gòu)建盲腸結(jié)扎穿刺CLP模型，獲取6h后腹腔灌洗液，采用confocal觀察其中NETs形成的情況。進(jìn)一步采用熒光定量法分析兩種小鼠CLP后腹腔灌洗液中的NETs含量。實(shí)驗(yàn)二:為明確老年和年輕小鼠趨化能力差異對(duì)NETs形成的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CLP模型6h后腹腔募集的中性粒細(xì)胞比例。為排除衰老后骨髓中性粒細(xì)胞生成能力對(duì)募集到腹腔的中性粒細(xì)胞比例的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)

13、檢測(cè)老年和年輕小鼠骨髓中性粒細(xì)胞的比例。實(shí)驗(yàn)三:提取老年小鼠腹腔中性粒細(xì)胞，在體外用第一部分研究所述6種TLR2配體刺激6h后經(jīng)confocal觀察。進(jìn)一步采用熒光定量法對(duì)比年輕和老年小鼠NETs形成能力的差異。為明確除TLR2配體外其他刺激下老年小鼠中性粒細(xì)胞NETs形成是否也存在障礙，體外給予LPS刺激6h后經(jīng)confocal觀察并一步用定量分析證實(shí)。實(shí)驗(yàn)四:為明確中性粒細(xì)胞表面TLR2數(shù)量是否影響老年小鼠NETs形成，采用流式細(xì)胞

14、術(shù)檢測(cè)PGN刺激前后老年和年輕小鼠中性粒細(xì)胞膜表面TLR2數(shù)量。進(jìn)一步檢測(cè)TLR2配體誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生是否有差異。實(shí)驗(yàn)五:為明確年輕和老年小鼠中性粒細(xì)胞在TLR2配體刺激后自噬活性是否存在差異，采用Western blot檢測(cè)基礎(chǔ)水平和PGN刺激2、4、6h后中性粒細(xì)胞中LC3B的蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步證實(shí)低自噬活性參與了老年小鼠中性粒細(xì)胞NETs形成障礙，體外PGN刺激的同時(shí)，給予雷帕霉素以提高自噬活性，驗(yàn)證其能否改善老年組NETs形成。

15、實(shí)驗(yàn)六:分析公開發(fā)表的高通量轉(zhuǎn)錄組基因數(shù)據(jù)，尋找老年組和年輕組間自噬相關(guān)的差異表達(dá)基因。進(jìn)一步采用western blot驗(yàn)證差異基因的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)一:老年小鼠CLP6 h后腹腔灌洗液中NETs形成明顯少于年輕小鼠。定量分析的結(jié)果類似。實(shí)驗(yàn)二:老年小鼠CLP6 h后腹腔灌洗液中CD11b+Ly6G+細(xì)胞群比例低于年輕小鼠。而老年和年輕小鼠骨髓中性粒細(xì)胞群的比例無(wú)差異。實(shí)驗(yàn)三:老年中性粒細(xì)胞在TLR2配

16、體刺激下均不能有效形成NETs，熒光定量分析表明老年組NETs形成明顯低于年輕組。相比于年輕小鼠，LPS刺激的老年組NETs形成也存在障礙，定量分析得到類似結(jié)果。實(shí)驗(yàn)四:老年和年輕小鼠中性粒細(xì)胞膜表面TLR2數(shù)量在靜息狀態(tài)下和PGN刺激后無(wú)明顯差異。而6種TLR2配體體外刺激老年小鼠中性粒細(xì)胞3h誘導(dǎo)的胞內(nèi)ROS產(chǎn)量均低于年輕小鼠。實(shí)驗(yàn)五:年輕和老年小鼠的LC3B表達(dá)在PGN刺激后逐漸升高，在所有時(shí)間點(diǎn)，老年組的蛋白表達(dá)水平均低于年輕組

17、。體外同時(shí)給予PGN和雷帕霉素，老年小鼠中性粒細(xì)胞的NETs形成能力得到了一定程度的恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)六:高通量數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)ULK1、ATG13和ATG5的轉(zhuǎn)錄表達(dá)存在差異。Western blot結(jié)果表明各個(gè)時(shí)間點(diǎn)老年組ATG5的蛋白表達(dá)水平均低于相應(yīng)的年輕組，而ULK1、ATG13的表達(dá)差異不明顯，此外，老年組mTOR的表達(dá)水平略高于年輕組。
　　結(jié)論:
　　在體和體外多種TLR配體的刺激下，老年小鼠中性粒細(xì)胞NETs形成弱于年

18、輕小鼠。刺激后自噬活性低可能是原因之一。ATG5是老年小鼠中性粒細(xì)胞TLR信號(hào)誘導(dǎo)自噬活性缺陷的關(guān)鍵分子。還可能存在別的影響老年小鼠NETs形成的因素，包括趨化能力、ROS產(chǎn)量和mTOR活性。
　　第三部分老年小鼠中性粒細(xì)胞自噬缺陷致凋亡活性改變
　　目的:
　　正常情況下，靜息狀況的中性粒細(xì)胞會(huì)發(fā)生自發(fā)性凋亡;而活化的中性粒細(xì)胞除凋亡外還可以走向NETosis。老年小鼠中性粒細(xì)胞的NETs形成能力減弱，那么細(xì)胞凋亡水

19、平在老年個(gè)體上是否也發(fā)生改變？是否受同一細(xì)胞過(guò)程的調(diào)控？本部分研究假設(shè)一:在TLR2配體刺激下，老年小鼠中性粒細(xì)胞更傾向于凋亡。假設(shè)二:老年和年輕小鼠在凋亡和NETosis水平上的差異均受自噬活性的調(diào)控。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)一:為明確老年和年輕小鼠在TLR2配體刺激下凋亡活性是否存在差異，將老年和年輕小鼠的腹腔中性粒細(xì)胞體外給予PGN刺激6、12h，采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡比例。實(shí)驗(yàn)二:為明確TLR2信號(hào)誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞

20、凋亡是否受自噬調(diào)控，年輕小鼠中性粒細(xì)胞體外PGN刺激的同時(shí)，給予自噬抑制劑wortmannin或balfilomycin A1，觀察凋亡比例的變化。在老年細(xì)胞上重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步在年輕和老年小鼠中性粒上給予PGN和自噬增強(qiáng)劑，觀察凋亡變化。實(shí)驗(yàn)三:在年輕小鼠細(xì)胞上應(yīng)用PGN和自噬抑制劑，經(jīng)confocal同時(shí)觀察凋亡和NETosis水平，檢驗(yàn)自噬同時(shí)調(diào)控凋亡和NETosis的假說(shuō)。
　　結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)一:靜息6h和PGN刺

21、激6/12 h后，老年組的中性粒細(xì)胞凋亡比例均高于年輕組。實(shí)驗(yàn)二:同時(shí)給予PGN和wortmannin或balfilomycin A1相比于單純給予PGN進(jìn)一步提高了凋亡細(xì)胞的比例，老年細(xì)胞的結(jié)果類似。而自噬增強(qiáng)劑能夠減少凋亡比例。實(shí)驗(yàn)三:給予PGN和兩種自噬抑制劑后，細(xì)胞NETosis減少，凋亡明顯增加。
　　結(jié)論:
　　老年小鼠中性粒細(xì)胞在TLR2配體刺激下更傾向于凋亡，而非NETosis。中性粒細(xì)胞的自噬過(guò)程同時(shí)調(diào)控了