中國(guó)中性粒細(xì)胞MPO完全缺陷家系的分子機(jī)制研究.pdf

1、【目的】
　　通過對(duì)1個(gè)中性粒細(xì)胞髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)完全缺陷家系進(jìn)行系統(tǒng)的分子遺傳學(xué)研究,闡明中國(guó)MPO完全缺陷家系的分子遺傳學(xué)特征和MPO分子遺傳改變對(duì)其生理學(xué)、病理學(xué)作用的影響水平及其分子機(jī)制。為進(jìn)一步開展MPO生物合成機(jī)制及其生理和病理學(xué)研究提供有力的試驗(yàn)材料支持。
　　【方法】
　　1.收集家系血液樣本,分離中性粒細(xì)胞,并抽提基因組。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增MPO基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和12個(gè)外

2、顯子區(qū),分段擴(kuò)增MPO基因。比較分析家系樣本與正常對(duì)照間基因序列差異,繪制家系圖。
　　2.對(duì)中性粒細(xì)胞內(nèi)MPO進(jìn)行活性檢測(cè)、MPO細(xì)胞化學(xué)染色以及通過熒光顯微鏡觀察MPO熒光抗體與MPO的雜交信號(hào),從而分析MPO缺陷中性粒細(xì)胞內(nèi)MPO的氧化活性、表達(dá)水平以及定位情況。聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)分離中性粒細(xì)胞勻漿樣

3、本,利用MPO抗體通過Western-Blot分析中性粒細(xì)胞中MPO的存在情況。
　　3.分別提取放線菌酮(Cycloheximide,CHX)處理前后中性粒細(xì)胞總RNA,利用real-timeRTPCR技術(shù)檢測(cè)MPOmRNA相對(duì)正常對(duì)照的表達(dá)水平,研究此突變分子機(jī)制。
　　【結(jié)果】
　　1.通過對(duì)家系基因組序列分析,發(fā)現(xiàn)患者M(jìn)PO基因11號(hào)外顯子第1805個(gè)堿基由G突變?yōu)锳(TGG>TAG),提前產(chǎn)生終止密碼子,為W

4、602X純合子;而其家庭成員中患者母親及兒子均為W602X雜合子,此位點(diǎn)為G/A。家系圖譜提示此缺陷為常染色體隱性遺傳。
　　2.患者中性粒細(xì)胞中MPO活性不到正常對(duì)照總量的5％、MPO化學(xué)染色完全陰性、熒光顯微鏡顯示MPO熒光染色陰性、Western-Blot顯示患者M(jìn)PO完全缺陷,而正常對(duì)照染色陽性明顯?；颊吲畠号c兒子以上結(jié)果均接近正常對(duì)照一半。
　　3.Real-timeRTPCR顯示患者中性粒細(xì)胞MPOmRNA表達(dá)水

5、平不到正常對(duì)照1%,而中性粒細(xì)胞經(jīng)CHX處理后MPOmRNA表達(dá)水平明顯增高。提示中性粒細(xì)胞內(nèi)MPOmRNA存在降解,而此降解和無義突變介導(dǎo)的mRNA降解(nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD)密切相關(guān)。
　　【結(jié)論】
　　本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MPO完全缺陷患者一例,缺陷為11號(hào)外顯子第1805位堿基G突變?yōu)锳(TGG>TAG)所致(NG_009629.1:c.1805G>A),即W602X純合子突變。這一突變