中性粒細(xì)胞胞外陷阱及Ⅰ型脫氧核糖核酸酶在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中相關(guān)性的體外研究.pdf

1、目的：
　　探究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）患者外周血中性粒細(xì)胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)的形成情況與體外血清降解NETs過(guò)程，以及糖皮質(zhì)激素對(duì)NETs誘導(dǎo)形成的影響，并測(cè)定RA患者血清Ⅰ型脫氧核糖核酸酶（DNaseⅠ）的活性，以期發(fā)現(xiàn)NETs的發(fā)生與降解以及血清DNaseⅠ活性，及其三者間關(guān)系在RA發(fā)病機(jī)制中的潛在作用。
　　方法：

2、
　　收集2016年3月至2016年11月于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院確診的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者65例，并同時(shí)收集年齡性別比例相當(dāng)?shù)?0例健康體檢者作為對(duì)照組。收集并整理患者臨床評(píng)分及各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)。采集患者入院當(dāng)天外周靜脈血及血清，密度梯度離心法分離純化中性粒細(xì)胞，同時(shí)血清冰凍保存。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定中性粒細(xì)胞純度。用Sytox Green熒光染料對(duì)純化中性粒細(xì)胞染色，熒光顯微鏡下觀察兩組NETs形態(tài)并用免疫熒光染色技術(shù)分析NETs

3、組成成分，并分析地塞米松干預(yù)RA患者血清誘導(dǎo)NETs形成情況和RA血清降解NETs情況。輻射狀酶擴(kuò)散法測(cè)定血清DNaseⅠ活性。對(duì)血清降解NETs能力及血清DNaseⅠ活性進(jìn)行相關(guān)性分析，并比較NETs含量和血清DNaseⅠ活性與各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系。Image-Pro Plus6.0軟件對(duì)NETs含量及血清DNaseⅠ濃度進(jìn)行定量分析。統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。Graphpad Prism5軟件進(jìn)行圖表繪制。
　

4、　結(jié)果：
　　1.65例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者的外周血中檢測(cè)到了NETs的存在,且RA患者外周血NETs水平顯著高于同期健康體檢者外周血NETs水平（35.797%±1.606 vs0.250%±0.023，P<0.05）；
　　2.NETosis是一動(dòng)態(tài)連續(xù)過(guò)程，NETs的成分組成包含DNA和組蛋白；
　　3.RA患者外周血NETs含量與CRP、ESR以及DAS28評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.2615，P=0.0354

5、；r=0.2564，P=0.039；r=0.2456，P=0.0486)，而與RF和抗CCP抗體無(wú)關(guān)（r=0.1988，P=0.1124，n=65；r=0.1751，P=0.1631，n=65）；
　　4.用地塞米松預(yù)處理的中性粒細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)后產(chǎn)生的NETs水平顯著低于未用地塞米松預(yù)處理的中性粒細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的NETs水平（20.256%±1.799 vs51.061%±2.761，P<0.05）；
　　5.RA患者體

6、外血清降解NETs比例顯著低于健康體檢者體外血清降解NETs比例（57.430%±7.708 vs94.189%±4.676，P<0.05)；
　　6.RA患者血清DNaseⅠ活性顯著低于健康體檢者血清DNaseⅠ活性(0.346±0.136U/ml vs0.489±0.168U/ml，P<0.05）；
　　7.RA患者血清DNaseⅠ活性與CRP和ESR呈負(fù)相關(guān)（r=-0.3250，P=0.0155；r=-0.2837，P

7、=0.0358），而與DAS28、RF和抗CCP抗體無(wú)關(guān)（r=-0.1516，P=0.2691，n=55；r=-0.059，P=0.6670，n=55；r=0.0115，P=0.9339，n=55）；
　　8.RA患者血清DNaseⅠ活性與體外血清NETs降解比例呈正相關(guān)（r＝0.5610，P=0.0001，n=35）。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了RA患者外周血中有NETs的存在，且其含量顯著高于健康對(duì)照組(P<0.

8、05)，NETs水平高低能反映疾病活動(dòng)度情況。與此同時(shí)，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)NETosis是一動(dòng)態(tài)連續(xù)過(guò)程，NETs成分組成包含DNA及組蛋白，推測(cè)其成分可能參與RA的發(fā)病機(jī)制。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RA患者血清能誘導(dǎo)形成NETs，且經(jīng)地塞米松預(yù)處理的中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)生成的NETs含量顯著低于未經(jīng)地塞米松預(yù)處理的中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)生成的NETs含量（P<0.05）；RA患者血清降解NETs比例顯著低于健康對(duì)照組（P<0.05），RA患者血清DNaseⅠ活性顯著