高遷移率族蛋白1對(duì)抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外羅網(wǎng)形成影響的研究.pdf

1、第一部分高遷移率族蛋白1促進(jìn)抗中性粒細(xì)胞抗體誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞細(xì)胞外羅網(wǎng)形成
　　目的：在體外探討高遷移率族蛋白1（HMGB1）是否可以通過促進(jìn)抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（ANCA）誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞細(xì)胞外羅網(wǎng)（NETs)形成，從而參與ANCA相關(guān)性小血管炎（AAV）的發(fā)病過程。
　　方法：通過密度梯度離心法提取健康獻(xiàn)血員外周血中性粒細(xì)胞。在體外，用HMGB1及活動(dòng)期AAV患者血漿置換液中提取的ANCA-lgG共同刺激中性粒細(xì)胞，細(xì)胞免疫

2、熒光染色觀察NETs的形成，并計(jì)算形成的百分比。Pico-green dsDNA/NETs染色通過熒光強(qiáng)度檢測dsDNA/NETs濃度進(jìn)行NETs的定量。
　　結(jié)果：細(xì)胞免疫熒光染色可以觀察到HMGB1與ANCA共同刺激組有典型NETs的形成，與空白對(duì)照、單獨(dú)HMGB1或ANCA刺激組相比，HMGB1與ANCA共同刺激NETs形成的百分比明顯增加。同樣的dsDNA/NETs染色熒光強(qiáng)度NETs定量分析發(fā)現(xiàn)，HMGB1與MPO-AN

3、CA共同刺激組中性粒細(xì)胞dsDNA/NETs的濃度，分別與空白對(duì)照、單加HMGB1或MPO-ANCA、健康lgG+HMGB1組相比明顯增加。HMGB1與PR3-ANCA共同刺激組中性粒細(xì)胞dsDNA/NETs的濃度，分別與空白對(duì)照、單加HMGB1或PR31-ANCA、健康lgG+HMGB1組相比明顯增加。單加HMGB1或ANCA、健康lgG+HMGB1分別與空白對(duì)照比較無明顯差異。
　　結(jié)論：HMGB1促進(jìn)ANCA誘導(dǎo)NETs形成

4、，從而參與AAV的發(fā)病過程。
　　第二部分高遷移率族蛋白1促進(jìn)中性粒細(xì)胞細(xì)胞外羅網(wǎng)形成需要依賴受體TLRs及RAGE
　　目的：體外實(shí)驗(yàn)已證明HMGB1可以通過促進(jìn)ANCA誘導(dǎo)NETs的形成，從而參與AAV的致病過程，本研究旨在探討在該過程中HMGB1發(fā)揮效應(yīng)所依賴的受體情況以及是否需要NADPH氧化酶。
　　方法：通過密度梯度離心法提取健康獻(xiàn)血員外周血中性粒細(xì)胞。在體外，分別加入Toll樣受體（TLR）2、TLR4及

5、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）抑制劑或阻斷劑以及NADPH氧化酶抑制劑DPI預(yù)處理中性粒細(xì)胞后，分別給予HMGB1及活動(dòng)期AAV患者血漿置換液中提取的ANCA-lgG刺激，Pico-green dsDNA/NETs染色熒光強(qiáng)度及細(xì)胞免疫熒光染色進(jìn)行NETs的定量分析。
　　結(jié)果：dsDNA/NETs染色熒光強(qiáng)度NETs定量分析提示，HMGB1與MPO-ANCA共同孵育組中性粒細(xì)胞dsDNA/NETs的濃度為537.25±90.

6、11 ng/ml，預(yù)先加入TLR2、TLR4及RAGE抑制劑或阻斷劑處理組dsDNA/NETs的濃度與其比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HMGB1與PR3-ANCA共同孵育組中性粒細(xì)胞dsDNA/NETs的濃度為540.33±142.82 ng/ml，預(yù)先加入TLR2、TLR4及RAGE抑制劑或阻斷劑處理組dsDNA/NETs的濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞免疫熒光染色NETs形成百分比分析以及TLR2、TLR4基因敲除的小鼠骨髓