金黃色葡萄球菌臨床菌株中Ⅲ-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)的鑒定與功能研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是人類重要的病原細(xì)菌，可引起多種感染性疾病。面對來自宿主和環(huán)境的壓力，金黃色葡萄球菌不斷地進(jìn)化以提高自身的適應(yīng)能力，從而抵抗真核宿主的免疫系統(tǒng)及環(huán)境中的殺菌因素。其適應(yīng)環(huán)境的主要方式之一是通過水平基因轉(zhuǎn)移獲取可移動遺傳元件如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子及噬菌體之上的毒力和抗生素抗性相關(guān)基因。
　　原核生物中成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白(clusteredregularly interspaced short palin

2、dromic repeats[CRISPR]-CRISPR associated proteins[Cas])組成CRISPR-Cas系統(tǒng)，具有特異性靶向入侵核酸的功能，其靶標(biāo)主要是噬菌體和質(zhì)粒等可移動元件。目前為止，國外有幾個金黃色葡萄球菌臨床菌株被發(fā)現(xiàn)含有Ⅲ-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)，但沒有相關(guān)的功能研究報道。在金黃色葡萄球菌的近親表皮葡萄球菌RP62a中，其Ⅲ-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫功能已經(jīng)得到驗證。此外，有研究發(fā)

3、現(xiàn)一些Ⅰ型和Ⅱ型系統(tǒng)還參與了細(xì)菌的生理和毒力調(diào)控過程。國內(nèi)金黃色葡萄球菌臨床菌株中CRISPR-Cas系統(tǒng)的分布情況，其免疫功能及其他生理調(diào)節(jié)功能，在本研究之前都未見報道。
　　本論文主要進(jìn)行了三個方面的工作:
　　首先，我們根據(jù)三個已報道CRISPR-Cas系統(tǒng)的序列設(shè)計了針對四個cas基因用于PCR篩選的簡并引物。最終我們從六百多個臨床菌株中得到6個含Ⅲ-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)的金黃色葡萄球菌臨床菌株，并隨后對這六

4、個菌送樣進(jìn)行了全基因組二代重測序。其中5個新篩選菌株與已報道菌株有相似的CRISPR序列，但MLST，spa分型顯示它們在種系發(fā)生上距離較遠(yuǎn)。這說明CRISPR-Cas系統(tǒng)可以在菌株間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移，而不僅僅通過垂直遺傳的方式進(jìn)行傳播。在已報道菌株和新發(fā)現(xiàn)的5個MRSA菌株中，CRISPR-Cas系統(tǒng)都與SCCmec鄰近，這提示CRISPR-Cas系統(tǒng)的整合位點可能在基因組上SCCmec插入位置的附近。對CRISPR序列的分析發(fā)現(xiàn)，葡萄球

5、菌中Ⅲ-A型系統(tǒng)的重復(fù)序列(repeat)具有高度保守性，而間隔序列(spacer)的同源序列大部分發(fā)現(xiàn)于噬菌體中裂解區(qū)的模板鏈上。此外，對六個菌株的比較發(fā)現(xiàn)，spacer數(shù)量較少的AH1菌株含有比其他五個菌株更多的抗性基因和毒性基因，這也許與CRISPR-Cas系統(tǒng)阻止可移動元件轉(zhuǎn)移的功能有關(guān)。
　　同時，我們在AH1菌株中進(jìn)行了CRISPR-Cas系統(tǒng)免疫功能與機(jī)制的研究。質(zhì)粒侵染實驗發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌的Ⅲ-A型CRISPR

6、-Cas系統(tǒng)可以阻止含spacer同源序列質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，且此過程依賴于靶序列的轉(zhuǎn)錄。對靶標(biāo)的識別需要crRNA與靶標(biāo)RNA的序列互補(bǔ)，其中在crRNA5'端的堿基配對比3'端的更重要。CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫功能還依賴于Cas蛋白，其中核酸內(nèi)切酶Cas6和Csm各組分參與了此過程。
　　此外，為了研究臨床金黃色葡萄球菌中CRISPR-Cas系統(tǒng)除免疫之外的功能，我們對AH1，AH3和SH3三個菌及它們的CRISPR序列敲除菌株

7、進(jìn)行了RNA-seq。高通量測序數(shù)據(jù)顯示，在三個菌株中各自的CRISPR影響了不同基因的表達(dá)。其中在AH3菌株中，CRISPR敲除導(dǎo)致了包括氮代謝和毒性相關(guān)基因在內(nèi)的一些基因群的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化。Real-time PCR的實驗結(jié)果確認(rèn)了毒力基因spa和sspABC及調(diào)控因子sarS在轉(zhuǎn)錄水平的改變。
　　通過以上研究，我們在臨床菌株中確定了金黃色葡萄球菌CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)識別依賴于crRNA與靶R