saRNA上調(diào)p21WAF1-CIP1和VEZT基因?qū)ξ赴┘毎麗盒孕袨橛绊懙难芯?pdf

1、研究背景和目的:
　　胃癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高同時也是致死率最高的惡性腫瘤之一，僅2012年，新診斷的胃癌患者就達到952000人;在我國其發(fā)病率及致死率在所有惡性腫瘤中更是首屈一指。從全球范圍來看，近年來胃惡性腫瘤的發(fā)病率逐年降低，但是由于總?cè)丝跀?shù)目的增多，人均壽命的增長及老年人的增多等不同原因，新的胃惡性腫瘤患者數(shù)目在不斷增加。目前認為胃癌的發(fā)生是多種因素相互作用的結(jié)果，而癌基因的異常表達是其不可或缺的一部分，即與胃癌發(fā)生發(fā)

2、展相關(guān)的原癌基因的異常高表達和/或抑癌基因的反常低表達甚至沉默是導(dǎo)致胃惡性腫瘤不斷進展的重要致病因素，因此深入研究能夠?qū)е挛赴┑母鞣N遺傳物質(zhì)的變化尤其是基因的脫變、缺失等在胃癌進展中的作用機制，找到治療胃惡性腫瘤的新途徑或者是新的靶點，可以為其預(yù)防以及治療提出切實可行的的方法或途徑。
　　早在1969年Britten等就已經(jīng)提出激活RNA(activator RNA)的概念，但未獲得證實，此后直到2006年Li和Janowski等

3、才分別發(fā)現(xiàn)并命名saRNA和RNAa:小分子的雙鏈非編碼RNA可以上調(diào)或增強靶基因的表達，而這種效應(yīng)主要發(fā)生在DNA進行轉(zhuǎn)錄的時候，因此這種現(xiàn)象叫RNA激活(RNAa)，而這種小分子的雙鏈非編碼RNA則稱為激活小RNA（saRNA）。隨后有關(guān)RNAa原理及作用機制的研究被不斷地報道，進一步證實了RNAa的可行性。
　　p21WAF1/ CW1(p21)，是一種受體廣泛的細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑，位于6p染色體，編碼分

4、子量為21k-Da的蛋白質(zhì)，是野生型p53抑癌基因應(yīng)對各種因素引起的基因損傷的下游激活產(chǎn)物，p21可以通過多種細胞信息傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細胞周期，改變細胞周期的進程調(diào)控細胞的增殖，這其中最為重要的是通過抑制某種特定的CDK復(fù)合物的活性，使細胞周期停止在G1期。針對p21WAF1/ CIP1(p21)基因的小激活RNA(saRNA)，dsP21-322，已經(jīng)在肝癌，肺癌，膀胱癌等多種癌細胞系中驗證了有效性，但是在胃癌細胞中卻未見相關(guān)報道。本研究

5、擬應(yīng)用RNA激活技術(shù)重新激活胃癌細胞中p21WA1/ CIP1(p21)基因的表達，明確小激活RNA(saRNA)轉(zhuǎn)染胃癌細胞SGC-7901和M-28的最佳條件乃至發(fā)揮激活/上調(diào)作用的必要因素，研究其對靶細胞中的特定基因啟動子的影響，進一步明確RNAa對惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等生物學行為的影響，為胃癌的基因治療提供必要的理論依據(jù)。
　　在前期的相關(guān)研究中，本課題組的實驗人員已經(jīng)驗證了saRNA（dsP21-322）在體外

6、培養(yǎng)的胃癌細胞SGC-7901和M-28中的生物學作用。為進一步研究其作用機制，我們選取了由本課題組首次發(fā)現(xiàn)的抑癌基因VEZT為小激活RNA(saRNA)的靶基因。VEZT基因是近年新發(fā)現(xiàn)的與胃癌的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)的抑癌基因。VEZT-在染色體的位置是12q22，具有12個外顯子和11個內(nèi)含子，編碼的是一種由相連的三個組份組成的跨膜蛋白。VEZT蛋白主要包括三部分:短的細胞外區(qū)域，跨膜區(qū)域和長的細胞內(nèi)區(qū)域，其中細胞外區(qū)域結(jié)合肌球蛋白ⅦA

7、(myosinⅦA)。前期的相關(guān)實驗結(jié)果證明，上調(diào)胃SGC-7901和M-28細胞中VEZT的表達可以抑制胃SGC-7901和M-28細胞的生長、侵襲和遷移;VEZT的表達受啟動子區(qū)特定部位的甲基化的影響，此外某一些非編碼的由22個核苷酸組成的單鏈microRNA也能夠影響VEZT的表達，而這種影響因素又和saRNA及RNAa上調(diào)目的基因的機制密切相關(guān)。因此為進一步證實saRNA的激活效應(yīng)，以及探索saRNA的設(shè)計原則和作用機制，本研究

8、針對VEZT的肩動子序列，通過生物學軟件設(shè)計了幾條saRNA。隨后通過Western Blot以及qRT-PCR篩選出能夠顯著提高VEZT蛋白和mRNA的含量的saRNA序列，然后以篩選出的saRNA轉(zhuǎn)染胃癌細胞，進行相關(guān)實驗。同時，構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-shRNA表達載體加以轉(zhuǎn)染，以排除saRNA的脫靶效應(yīng)，從而進一步明確saRNA的靶向效應(yīng)對胃癌細胞增殖、侵襲及遷移的影響。
　　方法:
　　通過查找相關(guān)文獻獲取

9、針對p21WAF1/ C1P1(p21)基因的有效saRNA序列，即dsP21-322，以及dsControl（陰性對照序列）并加以合成。將不同濃度的dsP21-322轉(zhuǎn)染胃癌細胞SGC-7901和M-28中。通過Western Blot篩選最合適的轉(zhuǎn)染濃度。然后用選定的dsP21-322濃度處理SGC-7901和M-28細胞，處理時間長短各不相同。通過Western Blot篩選最合適的作用時間。按照上述篩選出的saRNA最佳作用濃度

10、和時間，將dsP21-322、陰性對照序列(dsControl)均分別轉(zhuǎn)入人胃SGC-7901和M-28細胞，即dsP21-322轉(zhuǎn)染的SGC-7901和M-28作為實驗組，dsControl轉(zhuǎn)染的SGC-7901和M-28起陰性對照的作用，即dsControl組，用不含任何RNA序列的轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000處理目的細胞作為空白對照組，Mock組。通過CCK-8實驗，觀察并評估saRNA對胃SGC-7901和M-28細胞增殖能力的影響

11、;通過Transwell assay觀察并評估dsP21-322對胃SGC-7901和M-28細胞侵襲和遷移能力的影響，
　　通過生物學軟件設(shè)計針對胃癌細胞中抑癌基因VEZT的saRNA、dsControl序列，并加以合成。將合成好的saRNA分別轉(zhuǎn)入胃癌細胞系SGC-7901和M-28中，通過Western Blot以及qRT-PCR檢測VEZT蛋白和mRNA的含量，進而篩選出有效的saRNA。隨后篩選出的有效saRNA被轉(zhuǎn)入人

12、胃SGC7901和M-28細胞，將同時轉(zhuǎn)有shRNA和篩選出的saRNA的SGC-7901、 M-28細胞，也就是saRNA-shRNA組，作為陰性對照，以排除saRNA的脫靶效應(yīng)，shRNA表達載體是帶有熒光標記的pGPU6/GFP/Neo-shRNA。通過CCK-8實驗以及Transwell assay實驗評估篩選出的saRNA對SGC-7901和M-28惡性行為的影響。
　　結(jié)果:
　　1.dsP21-322能有效上調(diào)

13、人胃癌細胞SGC-7901和M-28 p21WAF1/CIP1(p21)基因表達，這種激活目的細胞的特定基因的行為具有時間劑量依賴性。
　　2.dsP21322的激活效應(yīng)在轉(zhuǎn)染濃度為50nM，作用時間為72h時激活效應(yīng)的綜合效果最好。
　　3.dsP21-322能夠通過上調(diào)SGC-7901和M-28細胞p21WAF1/ CIP1(p21)mRNA及蛋白質(zhì)的含量，抑制靶細胞的惡性行為。
　　4.dsVEZT-94，能通過

14、上調(diào)人胃癌細胞SGC-7901和M-28 VEZT mRNA及蛋白質(zhì)的含量，進而抑制靶細胞的惡性行為。
　　結(jié)論:
　　在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)dsP21-322(saRNA)能夠有效上調(diào)p21WAF1/ CIP1(p21)基因的表達，提高p21WAF1/CIP1(p21)蛋白及mRNA的含量，進而抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移。此外，這種激活效應(yīng)具有時間劑量依賴性，在saRNA轉(zhuǎn)染濃度為50nM，轉(zhuǎn)染時間為72h時，激活效應(yīng)激

15、活效應(yīng)的綜合效果最好。dsVEZT-94，能通過上調(diào)體外培養(yǎng)的靶細胞系SGC-7901和M-28 VEZT mRNA及蛋白質(zhì)的含量，進而抑制靶細胞的惡性行為。本研究中這種生物學惡性行為豐要包括增殖、侵襲和遷移。
　　saRNA通過作用于抑癌基因啟動子的特定序列，上調(diào)或激活靶基因的表達，從而實現(xiàn)抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移等惡性行為的目的，研究saRNA和RNAa的作用機制，能夠為胃癌甚至其他惡性腫瘤的預(yù)防或者是治療提供切實可行的