HMGCR對食管鱗癌細胞惡性行為的影響及分子機制研究.pdf

1、食管癌是我國最常見的消化道腫瘤之一。雖然隨著外科、麻醉、圍手術(shù)期處理以及重癥監(jiān)護條件和技術(shù)取得較大的提高，但是單純手術(shù)治療效果仍不理想。其原因在于食管癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制目前仍不清楚，導(dǎo)致食管癌療效欠佳。腫瘤細胞代謝異常是腫瘤細胞顯著區(qū)別于正常細胞的顯著特征之一。從腫瘤代謝的角度尋找食管癌的治療靶點很可能為食管癌的治療帶來新的希望。甲羥戊酸(MVA, Mevalonate)途徑除了終產(chǎn)物膽固醇外，還能產(chǎn)生許多中間代謝產(chǎn)物，如類異戊二烯

2、，泛醌等。這些物質(zhì)在細胞重要的生理過程中發(fā)揮作用。甲羥戊酸代謝途徑在食管鱗癌發(fā)生中的功能目前仍不清楚。
　　在本研究中，我們克隆了甲羥戊酸代謝限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGCR)，并對其進行了功能和所涉機制的初步研究。在本研究中，我們收集食管鱗癌組織標(biāo)本，培養(yǎng)食管鱗癌細胞系，利用熒光定量PCR檢測食管鱗癌組織及其配對

3、的正常組織中HMGCR的mRNA水平，利用蛋白印跡檢測食管鱗癌組織和食管鱗癌細胞中HMGCR的蛋白水平。在細胞水平上，我們通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞，建立過表達HMGCR的食管鱗癌穩(wěn)定細胞株;設(shè)計RNA干擾序列，下調(diào)HMGCR在食管鱗癌細胞中的表達。我們利用MTT實驗、Boyden Chamber和軟瓊脂集落實驗分析HMGCR對食管鱗癌細胞生長、遷移和克隆形成的影響;利用GST-pulldown和蛋白印跡檢測HMGCR對Ras-ERK信

4、號通路的活化作用。最后，我們在食管鱗癌細胞中過表達或下調(diào)c-Myc的表達，通過熒光定量PCR和蛋白印跡檢測c-Myc的表達對HMGCR mRNA和蛋白水平的影響。
　　我們的研究結(jié)果顯示，與正常食管粘膜組織相比，HMGCR在食管鱗癌組織中的mRNA水平和蛋白水平均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。HMGCR在食管鱗癌細胞株中的表達水平高于永生化的食管粘膜上皮細胞。在食管鱗癌細胞Eca109和正常食管粘膜細胞SHEE中過表達HMGCR促進食管鱗癌細胞生

5、長、遷移和在軟瓊脂上克隆集落;在食管鱗癌細胞Eca109和Caes-17中下調(diào)HMGCR的表達抑制食管鱗癌細胞遷移和在軟瓊脂上克隆集落。在分子機制研究中，我們發(fā)現(xiàn)HMGCR過表達促進Ras活化，上調(diào)ERK磷酸化水平。在食管鱗癌細胞中，我們發(fā)現(xiàn)代謝的重要調(diào)控因子c-Myc上調(diào)HMGCR的mRNA水平和蛋白水平。
　　綜上所述，我們的研究結(jié)果提供了充分的證據(jù)，證明HMGCR在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要功能。同時，我們的研究也提示HM

6、GCR的抑制劑他汀用于食管鱗癌治療的可能性。本研究可以分為如下三個部分:
　　第一部分 HMGCR在食管鱗癌組織和食管鱗癌細胞中表達上調(diào)
　　目的:研究HMGCR在食管鱗癌組織及配對的正常組織、食管鱗癌細胞株中的表達模式。
　　方法:首先利用熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測HMGCR在40例食管鱗癌組織及配對的正常組織中的mRNA水平;使用蛋白印跡法，檢測隨機挑選的6例食管鱗癌組織及配對的正常組織中HM

7、GCR的蛋白水平，驗證熒光定量PC結(jié)果;最后，利用蛋白印跡檢測正常食管上皮細胞和食管鱗癌細胞中HMGCR的蛋白水平。
　　結(jié)果:mRNA水平的檢測結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中HMGCR的mRNA水平較配對的正常組織顯著升高;蛋白印跡實驗結(jié)果表明，食管鱗癌組織中HMGCR的蛋白水平較配對的正常組織顯著上調(diào)，這一結(jié)果與熒光定量PCR的結(jié)果一致;最后，對多種食管鱗癌細胞和正常食管上皮細胞的蛋白印跡結(jié)果顯示，HMGCR在正常食管上皮細胞中的表

8、達水平較低，在食管鱗癌細胞中的表達水平較高。
　　結(jié)論:在食管鱗癌組織和細胞系中，HMGCR的mRNA水平和蛋白水平均有較強的表達。與正常組織相比較，食管鱗癌組織中HMGCR的表達水平上升;與正常食管上皮細胞相比，HMGCR在鱗癌細胞中的表達水平升高。這些結(jié)果提示HMGCR在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中很可能起著非常重要的作用。
　　第二部分 HMGcR對食管鱗癌細胞生長、遷移和克隆集落的影響
　　目的:研究HMGCR對食管

9、鱗癌細胞惡性行為（如生長、遷移、克隆集落等）的影響，揭示HMGCR在食管鱗癌進展中的功能。
　　方法:利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HMGCR的表達載體（myc-HMGCR，帶myc標(biāo)簽）至食管鱗癌細胞Eca109和正常食管上皮細胞SHEE中;通過MTT法檢測HMGCR對食管鱗癌細胞Eca109和正常食管上皮細胞SHEE生長的影響;通過軟瓊脂集落法研究HMGCR對食管鱗癌細胞克隆形成能力的影響;借助于細胞遷移模型揭示HMGCR對食管鱗癌細胞Eca

10、109和正常食管上皮細胞SHEE遷移的影響。同時，制備HMGCR RNA干擾的病毒載體，在食管鱗癌細胞Eca109、Caes17中下調(diào)HMGCR的表達;利用軟瓊脂集落法揭示下調(diào)HMGCR的表達對食管鱗癌細胞克隆形成的影響;借助細胞遷移模型研究HMGCR表達下調(diào)對食管鱗癌細胞遷移能力的影響
　　結(jié)果:通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，在食管鱗癌細胞Eca109和正常食管上皮細胞SHEE中建立了穩(wěn)定表達細胞株，過表達帶myc標(biāo)簽的HMGCR。

11、MTT實驗結(jié)果表明，穩(wěn)定表達HMGCR促進食管鱗癌細胞Ecal09、正常食管上皮細胞SHEE的生長;細胞遷移實驗顯示，HMGCR在Eca109和SHEE細胞中的表達增加食管鱗癌細胞的運動能力;軟瓊脂集落形成實驗顯示，HMGCR在Eca109細胞中的表達促進其非錨定性生長。此外，我們構(gòu)建了HMGCR RNA干擾的慢病毒載體，非常有效地干擾HMGCR在食管鱗癌細胞Eca109和Caes17中的表達。細胞遷移實驗表明，HMGCR表達下降削弱了

12、食管鱗癌細胞Eca109和Caes17的運動能力;克隆集落形成實驗顯示，干擾HMGCR的表達使食管鱗癌細胞的非錨定性生長的能力受到抑制。
　　結(jié)論:HMGCR促進食管鱗癌細胞的生長、遷移、克隆形成能力，干擾HMGCR的表達抑制食管鱗癌細胞非錨定性生長和遷移。HMGCR對食管鱗癌的進展發(fā)揮促進作用。
　　第三部分 HMGCR在食管鱗癌細胞中激活Ra s-ERK信號通路
　　目的:研究HMGCR調(diào)控食管鱗癌細胞惡性行為（如

13、生長、遷移和克隆集落）的分子機制。
　　方法:利用GST-pull down平臺，研究HMGCR的表達Ras的活化作用及對ERK磷酸化水平的影響;通過熒光定量PCR和蛋白印跡，檢測c-Myc基因的表達對HMGCR的mRNA水平和蛋白水平的影響。
　　結(jié)果:GST-pull down分析顯示，過表達HMGCR促進Ras的活化，上調(diào)ERK的磷酸化水平。干擾HMGCR的表達抑制ERK的磷酸化。熒光定量PCR和蛋白印跡的實驗結(jié)果顯示