miRNA激活p21WAF1-CIP1基因表達(dá)及其對(duì)膀胱癌細(xì)胞的抑制作用.pdf

1、第一部分miRNAs激活膀胱癌細(xì)胞p21WAF1/CIP1基因表達(dá)及其機(jī)制
　　目的：篩選能和抑癌基因p21WAF1/CIP1（p21）啟動(dòng)子區(qū)域序列互補(bǔ)且評(píng)分較高的miRNAs，觀察miRNAs表達(dá)水平與臨床膀胱癌發(fā)生的相關(guān)性，檢測(cè)其對(duì)膀胱癌細(xì)胞系T24和EJ細(xì)胞p21是否有激活效應(yīng)，并初步探索其激活機(jī)制。
　　方法：采用miRanda算法檢索p21基因啟動(dòng)子區(qū)域和miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)里所有人miRNAs進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，尋找

2、評(píng)分較高的miRNA；應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)10對(duì)臨床膀胱癌組織和正常膀胱粘膜中這些miRNA和p21基因mRNA的表達(dá)水平；生物合成 dsControl，dsP21-322，miR-103b mimic，miR-370-5p mimic（miR-370 mimic），miR-1180-5p mimic（miR-1180 mimic）和miR-1236-3p mimic（miR-1236 mimic）（其中dsControl為陰性對(duì)

3、照，dsP21-322為陽(yáng)性對(duì)照），通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（終濃度為50 nM），在膀胱癌細(xì)胞系T24和EJ細(xì)胞中過表達(dá)這些dsRNAs和miRNAs，72小時(shí)后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot分別檢測(cè)p21 mRNA和蛋白表達(dá)水平；通過免疫熒光染色觀察p21蛋白亞細(xì)胞表達(dá)位置；采用亞細(xì)胞蛋白提取試劑盒抽提T24和EJ細(xì)胞蛋白，Western blot進(jìn)一步檢測(cè)p21蛋白在胞漿和胞核表達(dá)水平。另外，合成3’或5’端標(biāo)記生物素的

4、miRNAs以及反義鏈3’或5’端標(biāo)記生物素的dsControl，進(jìn)而轉(zhuǎn)染到T24和EJ細(xì)胞內(nèi)，72小時(shí)后采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）檢測(cè)生物素標(biāo)記的dsRNA和miRNAs是否與p21啟動(dòng)子相結(jié)合。
　　結(jié)果：通過miRanda算法檢索出miR-103b，miR-370，miR-1180和miR-1236分別與p21啟動(dòng)子區(qū)域-907/-887，-552/-537，-397/-379以及-243/-226互補(bǔ)匹配評(píng)分較高

5、。實(shí)時(shí)熒光定量PCR提示相比正常膀胱粘膜細(xì)胞，miR-103b在膀胱癌中呈高表達(dá)，但差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；miR-370，miR-1180以及miR-1236在膀胱癌中低表達(dá)，與正常膀胱粘膜細(xì)胞相比，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。p21 mRNA在膀胱癌中也呈低表達(dá)，和正常膀胱粘膜細(xì)胞相比，其差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；行Pearson相關(guān)分析，miR-370，miR-1180和miR-1236表達(dá)

6、和p21 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-103b表達(dá)與p21 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染T24和EJ細(xì)胞72小時(shí)后，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和Western blot顯示與 Mock和dsControl相比，dsP21-322，miR-370，miR-1180和miR-1236能顯著誘導(dǎo)p21 mRNA和蛋白表達(dá)，miR-103b未能誘導(dǎo)p21高表達(dá)。免疫熒光提示dsP21-322，miR-370，miR

7、-1180和miR-1236主要誘導(dǎo)T24和EJ細(xì)胞核p21高表達(dá)，亞細(xì)胞蛋白Western blot檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)此現(xiàn)象。ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染72小時(shí)后 miR-370，miR-1180和miR-1236主要通過與p21基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而激活p21表達(dá)。
　　結(jié)論：miR-370，miR-1180和miR-1236在人膀胱癌呈低表達(dá)，與p21 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)；miR-370，miR-1180和miR-1236能通

8、過與p21基因啟動(dòng)子直接結(jié)合而激活T24和EJ細(xì)胞的p21表達(dá)，并且主要激活胞核內(nèi)p21表達(dá)。
　　第二部分miRNA通過激活p21基因表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞的抑制作用
　　目的：探討miR-370，miR-1180和miR-1236對(duì)膀胱癌T24和EJ細(xì)胞的增殖，周期，凋亡，衰老，集落形成，遷移和侵襲的影響。
　　方法：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染dsControl，dsP21-322，miR-370 mimic，miR-1180 mimi

9、c和miR-1236 mimic到膀胱癌T24和EJ細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，利用普通PCR擴(kuò)增細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白（Cyclin D1）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK4和CDK6）的cDNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Cyclin D1，CDK4和CDK6 mRNA的表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T24和EJ細(xì)胞周期分布和凋亡情況；β-半乳糖苷酶染色觀察T24和EJ細(xì)胞衰老情況；結(jié)晶紫染色觀察轉(zhuǎn)染后10天細(xì)胞集落形成情況；Cel

10、lTiter96○R AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（MTS）檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)，96小時(shí)和120小時(shí)等5個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖情況；Transwell法檢測(cè)膀胱腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力；共轉(zhuǎn)染特異性抑制p21的干擾RNA（siP21）和miR-1236，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)p21 mRNA表達(dá)水平；并觀察共轉(zhuǎn)染siP21和miR-1236對(duì)細(xì)胞周期、集落形成和細(xì)胞增

11、殖的影響。
　　結(jié)果：在膀胱癌T24和EJ細(xì)胞中，與空白對(duì)照Mock和陰性對(duì)照dsControl轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染dsP21-322，miR-370 mimic，miR-1180 mimic和miR-1236 mimic后72小時(shí)能顯著抑制CDK4，CDK6和Cyclin D1 mRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期循環(huán)G0/G1期停滯；進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析顯示，相比Mock和dsControl組，兩種細(xì)胞轉(zhuǎn)染dsP21-322，miR-370 m

12、imic，miR-1180 mimic和miR-1236 mimic后細(xì)胞G0/G1期比例升高，其差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；轉(zhuǎn)染72小時(shí)，dsP21-322，miR-370 mimic，miR-1180 mimic和miR-1236 mimic轉(zhuǎn)染組處于早期和晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；并且可以顯著的誘導(dǎo) T24和EJ細(xì)胞衰老；克隆增值實(shí)驗(yàn)表明，相比 Mock和dsControl組，ds

13、P21-322，miR-370 mimic，miR-1180 mimic和miR-1236 mimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞集落形成數(shù)量明顯減少，集落面積顯著變小，集落形成率顯著降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；MTS檢測(cè)提示在轉(zhuǎn)染后第4天（96小時(shí)），較Mock和dsControl轉(zhuǎn)染組，dsP21-322，miR-370，miR-1180和miR-1236能顯著抑制膀胱癌T24和EJ細(xì)胞增殖（P<0.05）；Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)

14、，dsP21-322，miR-370，miR-1180和miR-1236較Mock和dsControl能顯著抑制T24和EJ細(xì)胞的遷移和侵襲能力（P<0.05）；因在3個(gè)miRNA中，miR-1236在膀胱癌組織標(biāo)本中表達(dá)水平最低的，故采用 miR-1236進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。在 T24和EJ細(xì)胞分別共轉(zhuǎn)染miR-1236 mimic和siP21后能顯著抑制miR-1236誘導(dǎo)的p21 mRNA高表達(dá)；并且，siP21可有效消除miR-123

15、6對(duì)細(xì)胞周期循環(huán)、集落形成和細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　結(jié)論：dsP21-322，miR-370 mimic，miR-1180 mimic和miR-1236 mimic轉(zhuǎn)染膀胱癌T24和EJ細(xì)胞可抑制Cyclin D1，CDK4和CDK6的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期循環(huán)停滯于 G0/G1期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和衰老，抑制腫瘤細(xì)胞集落形成和增殖。此外，miR-1236主要通過激活抑癌基因 p21的表達(dá)而誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞周期循環(huán)G0/G1期停滯，抑