p21waf1-cip1在錳誘導的神經(jīng)毒性中的作用及調(diào)控機制研究.pdf

1、錳是一種常見的環(huán)境和職業(yè)污染物，可通過呼吸道、消化道等多種途徑進入人體蓄積并產(chǎn)生不良作用。因此，錳對人體的影響正日益受到重視。錳神經(jīng)毒性的主要病變部位位于蒼白球、尾狀核、殼核和黑質(zhì)，在臨床上主要表現(xiàn)為錐體外系神經(jīng)受損癥狀，這可能與錳選擇性的蓄積部位有關。研究證明，腦代謝異常和多巴胺能神經(jīng)元損傷可能是錳中毒導致震顫性麻痹的主要原因。盡管國內(nèi)外已進行了一系列研究，但錳神經(jīng)毒性的確切機制仍不清楚。
　　我們近來的研究發(fā)現(xiàn)，錳中毒除了可引

2、起多巴胺能神經(jīng)元損傷，還可使大鼠黑質(zhì)紋狀體和多巴胺能的PC12細胞p21表達明顯升高。p21作為細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子，是CIP家族的一員，它可直接與CDK1、CDK2、CDK4和cyclinA、B、D、E共同參與形成具有酶活性的復合物，發(fā)揮細胞周期調(diào)節(jié)功能。越來越多的研究證實，p21不僅僅是在細胞分裂中發(fā)揮功能，p21還可通過p53依賴或p53非依賴途徑在細胞死亡中起到重要的調(diào)節(jié)作用。還有研究證實細胞生長異常以及細胞增殖調(diào)控機制

3、與神經(jīng)退行性變密切相關，細胞周期相關蛋白的表達可能參與了多種慢性神經(jīng)變性疾病的發(fā)病機制。此外關于神經(jīng)細胞的研究也證實了細胞周期蛋白在神經(jīng)元凋亡中的作用。
　　目的：
　　通過建立錳中毒的動物和細胞模型，觀察錳對p21表達的影響，并進一步通過體外實驗探討p21在錳誘導的神經(jīng)毒性中的作用及表達調(diào)控機制，從而為進一步闡明錳的神經(jīng)毒性作用提供新的思路和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1．使用腦立體定位注射方法建立錳中毒的動物

4、模型，采用免疫熒光染色、westernblot和RT-PCR檢測多巴胺能神經(jīng)元的損傷和p21表達的改變；
　　2．利用PC12細胞建立錳中毒的細胞模型，MTT、臺盼藍染色、流式細胞術等檢測細胞毒性；
　　3．Westernblot、免疫熒光染色和siRNA轉(zhuǎn)染等檢測p21在錳誘導的細胞毒性中的作用；
　　4．Westernblot、RT-PCR、熒光素酶報告基因等方法檢測錳對p21的表達調(diào)控機制。
　　結果：

5、r>　　1．錳對大鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷和p21表達的影響
　　通過腦立體定位注射方法建立大鼠錳中毒的動物模型；免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)染錳后可造成大鼠黑質(zhì)部位TH免疫反應陽性細胞數(shù)目明顯減少，RT-PCR和westernblot結果證實在多巴胺能神經(jīng)元損傷的同時，伴隨著p21mRNA和蛋白水平明顯升高。
　　2．p21在錳誘導的多巴胺能PC12細胞損傷中的作用
　　MTT和臺盼藍染色結果顯示，染錳后可造成PC12細胞活力明顯減

6、弱，且呈現(xiàn)時間和劑量依賴的趨勢；流式細胞儀結果顯示，錳染毒后PC12細胞的增殖受到抑制，細胞周期發(fā)生阻滯；RT-PCR和westernblot結果發(fā)現(xiàn)錳可引起PC12細胞p21mRNA和蛋白水平升高，而對其它相關分子表達沒有明顯改變；免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)染錳后p21有向核聚集的趨勢；p21siRNA轉(zhuǎn)染進一步證實了p21在錳誘導的細胞生長和增殖中的作用，說明p21蛋白轉(zhuǎn)位和表達改變可能參與了錳誘導的細胞毒性過程。
　　3．錳誘導的PC

7、12細胞p21蛋白表達的調(diào)控機制
　　通過CHX預處理，我們發(fā)現(xiàn)錳誘導p21表達主要通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)；熒光素酶報告基因結果顯示，錳可使p21啟動子活性增強，從轉(zhuǎn)錄起始水平增加p21的轉(zhuǎn)錄；錳并不影響PC12細胞p21mRNA和蛋白水平的穩(wěn)定性體內(nèi)體外模型westernblot結果還發(fā)現(xiàn)，錳可使DNA損傷標記物p-H2AX和p53水平升高，但p21是否通過p53依賴方式被激活還有待進一步研究
　　結論：
　　本研究首先通

8、過體內(nèi)實驗，發(fā)現(xiàn)錳可造成大鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷和p21表達增加；體外研究也證實錳對多巴胺能的PC12細胞具有明顯的毒性作用，而p21在細胞中異常表達可能是錳對多巴胺能神經(jīng)細胞產(chǎn)生毒性作用的重要機制之一；隨后從轉(zhuǎn)錄和翻譯后水平探討錳對p21蛋白表達的調(diào)控機制，發(fā)現(xiàn)錳可通過激活p21啟動子，從轉(zhuǎn)錄起始水平調(diào)控p21蛋白的表達，同時發(fā)現(xiàn)錳并不影響PC12細胞p21mRNA和蛋白的穩(wěn)定性；此外，體內(nèi)體外實驗均證實，錳還可引起DNA損傷和p53蛋