基于MAPKs和線粒體功能crosstalk的環(huán)維黃楊星D改善醛固酮誘導心肌細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、目的：建立醛固酮（ALD）誘導心肌細胞凋亡模型，研究MAPKs信號和線粒體功能在醛固酮介導心肌細胞凋亡過程中的作用，進一步研究環(huán)維黃楊星D（CVB-D）對醛固酮誘導心肌細胞凋亡的保護作用，探討CVB-D對心肌細胞凋亡的保護機制，為CVB-D預防和治療心血管疾病提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法:采用胰蛋白酶消化新生1-3 d SD大鼠心臟組織，差速貼壁法分離心肌細胞，培養(yǎng)前三天加入終濃度為0.1 mmol/L5-溴脫氧核苷抑制成纖維細胞的增

2、殖。使用倒置顯微鏡觀察細胞在不同時間的形態(tài)學變化并拍照；特異性肌鈣蛋白（Cardiac Troponin T，c-TnT）免疫細胞化學染色鑒定心肌細胞并計算純度。采用MTT法觀察不同濃度的ALD對心肌細胞影響，最終確定ALD10μM、作用時間36 h作為心肌細胞凋亡模型復制條件；CVB-D濃度設(shè)定為0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM，預保護1 h，隨后使用ALD復制凋亡模型，最終確定CVB-D高、低劑量分別為10μM

3、和1μM。實驗共分為5組：正常對照組（Control），模型組(ALD，10μM)，ALD+CVB-D高劑量組（CVB-D（H），10μM），ALD+CVB-D低劑量組（CVB-D（L），1μM），ALD+螺內(nèi)酯組（Spiro，10μM）。MTT法檢測細胞的存活率；LDH外漏檢測心肌細胞膜的完整性；Giemsa染色法和HE染色法從形態(tài)學上觀察各組心肌細胞形態(tài)學的變化；流式細胞術(shù)和TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡情況，Western blo

4、t檢測各組p-P38、P38、p-JNK、JNK蛋白表達水平。使用P38抑制劑（SB203580，10μmol/L）、JNK抑制劑（SP600125，5μmol/L）、線粒體mPTP孔抑制劑米酵菌酸（bongkrekic acid solution，BA，20μmol/L）探究MAPK信號通路與線粒體之間的crosstalk，Western blot檢測各組p-P38、P38、p-JNK、JNK蛋白表達水平，JC-1熒光染色檢測線粒體膜

5、電位變化。
　　結(jié)果：胰酶消化法得到的原代心肌細胞在培養(yǎng)48 h后細胞伸出偽足并出現(xiàn)單個細胞或多個細胞的搏動，培養(yǎng)72 h后，細胞連接成片開始同步搏動；對心肌細胞特異性蛋白c-TnT進行免疫染色，其表達結(jié)果呈陽性，即胞漿中有深棕黃色顆粒出現(xiàn)，心肌細胞純度達到92%。ALD（10μM，36 h）作用心肌細胞后，OD490值降低（P＜0.01)，而LDH 外漏量升高(P＜0.05)；高、低劑量CVB-D（10μM，1μM）和

6、螺內(nèi)酯（10μM）處理之后經(jīng)MTT法測得的OD490值升高（P＜0.05或者P＜0.01)，LDH外漏量降低（P＜0.05或者P＜0.01)。HE和Giemsa染色法證實ALD可誘導心肌細胞產(chǎn)生損傷（P＜0.01)，而CVB-D和螺內(nèi)酯可以改善ALD誘導的心肌細胞損傷(P＜0.01)；流式細胞術(shù)證實ALD誘導心肌細胞凋亡，CVB-D和螺內(nèi)酯對ALD誘導心肌細胞凋亡具有顯著的抑制作用。Western blot實驗結(jié)果證實，ALD可誘導心肌

7、細胞p-P38、p-JNK蛋白表達上調(diào)，CVB-D和螺內(nèi)酯可不同程度下調(diào)其磷酸化表達。Western blot結(jié)果提示線粒體mPTP孔抑制劑可降低ALD誘導的p-P38和p-JNK表達增加，JC-1熒光染色顯示P38抑制劑及JNK抑制劑可逆轉(zhuǎn)ALD誘導的線粒體膜電位降低。
　　結(jié)論：ALD可誘導心肌細胞凋亡，作用機制與誘導心肌細胞p-P38和p-JNK蛋白表達上調(diào)，降低心肌細胞線粒體膜電位有關(guān)。MAPK信號通路與線粒體功能之間存在