Salubrinal對衣霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、缺血可觸發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，如果凋亡持續(xù)存在，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞進(jìn)行性丟失，甚至發(fā)展成為心力衰竭。最近研究表明除了caspase依賴的細(xì)胞凋亡途徑外，還存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。在缺氧、糖缺乏或藥物刺激等應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)未折疊或錯誤折疊蛋白積聚，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能受損并啟動適應(yīng)性的未折疊蛋白反應(yīng)。激活的跨膜蛋白PERK使真核翻譯起始因子2α亞單位（eIF2α）發(fā)生磷酸化，全面抑制蛋白的合成，從而，對細(xì)胞起到保護(hù)作用。如果應(yīng)激時間延長，未折

2、疊蛋白反應(yīng)保護(hù)機(jī)制不能代償，最終會通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路蛋白CHOP/GADD153和caspase-12的表達(dá)，引起細(xì)胞凋亡。
　　 衣霉素（tunicamycin，TM）是一種蛋白糖基化抑制劑，可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。Salubrinal是一種選擇性的磷酸酶抑制劑，可通過抑制eIF2α去磷酸化對抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的不良反應(yīng)。但兩者在心肌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)和保護(hù)作用還未見報道。本實(shí)驗(yàn)研究衣霉素是否通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑引起心肌細(xì)胞凋

3、亡，并研究salubrinal對衣霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其信號通路。
　　 1.探討衣霉素在誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡中的作用和可能的凋亡通路采用衣霉素對乳鼠原代心肌細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，通過MTT、DNA梯帶、流式細(xì)胞等方法觀察TM與心肌細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。用real time PCR和Western blot法檢測凋亡過程中GRP78、eIF2α、P-eIF2a和caspase-12表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①衣霉素能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞

4、發(fā)生凋亡，并且這種凋亡作用呈濃度依賴性和時間依賴性；②衣霉素早期可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未折疊蛋白反應(yīng)分子伴侶P-eIF2α和GRP78 mRNA及蛋白表達(dá)水平的升高，在后期引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路蛋白CHOP/GADD153上調(diào)和caspase-12裂解，提示衣霉素引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從未折疊蛋白反應(yīng)轉(zhuǎn)向前凋亡反應(yīng)。
　　 2.探討salubrinal對衣霉素誘導(dǎo)的乳鼠原代心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制采用MTT法、流式細(xì)胞、TUNEL的方

5、法檢測salubrinal對TM誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，用高內(nèi)涵篩選、Hoechst染色和Western印跡法檢測凋亡過程中GRP78、eIF2α、P-eIF2a、CHOP/GADD153和裂解的caspase-12表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①salubrinal在100μM濃度范圍內(nèi)對心肌細(xì)胞是無毒安全的；②salubrinal可引起心肌細(xì)胞P-eIF2α蛋白表達(dá)水平的升高，且這種升高表現(xiàn)為濃度依賴性；③salubrinal本身不引