MAPKs通路在高糖誘導SD乳鼠心肌細胞凋亡中的作用.pdf

1、目的:
　　糖尿病心肌細胞凋亡是糖尿病心肌病最重要的病理變化之一，促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPK)鏈是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，是一類廣泛存在于真核細胞中的絲/蘇氨酸蛋白激酶。它是缺血、缺氧、激素作用、生長因子及細胞因子等各種細胞外刺激誘導基因表達、細胞增殖等核反應(yīng)的共同通路或匯聚點，在基因表達調(diào)控和細胞質(zhì)功能活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本實驗利用原代培養(yǎng)的乳鼠

2、心肌細胞為模型，研究高糖對心肌細胞凋亡的影響及分子通路機制和MAPK通路阻斷劑的抗心肌細胞凋亡作用，旨在探索糖尿病性心肌病藥物防治的新靶點。
　　方法:
　　1、心肌細胞的培養(yǎng):無菌條件下取新生1-3天的Sprague-Dawley(SD)大鼠，取心尖，剪碎成約1mm3大小，應(yīng)用0.1％的胰酶、0.04％的膠原酶Ⅱ的混合酶消化液分離心肌細胞，10％胎牛血清中和終止消化，應(yīng)用差速貼壁法獲取心肌細胞，置于37℃、5％C02的培養(yǎng)

3、箱培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入Brdu抑制成纖維細胞生長，每48小時更換培養(yǎng)基。倒置相差顯微鏡觀察心肌細胞形態(tài)，0.4％臺盼藍染色檢查心肌細胞成活率，免疫細胞化學染色鑒定心肌細胞純度。
　　2、分組:將培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞隨機分為7組:對照組，葡萄糖濃度為5.5mmol/L;高糖組，葡萄糖濃度為25mmol/L;高滲對照組:對照組+19.5mmol/L的D-甘露醇;DMSO組:高糖組+1μl/ml的DMSO預(yù)處理30分鐘;SB203580組:

4、高糖組+P38抑制劑SB203580預(yù)處理細胞30分鐘;PD98059組:高糖組+ERK抑制劑PD98059預(yù)處理細胞30分鐘;SP600125組:高糖組+JNK抑制劑SP600125預(yù)處理細胞30分鐘;
　　3、檢測指標:干預(yù)72h后，應(yīng)用流式細胞術(shù)分析各組細胞凋亡率，Westernblot檢測凋亡指標caspase-3蛋白的表達變化及p-JNK，p-P38蛋白表達的變化。
　　4、數(shù)據(jù)分析:所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(x±

5、s)表示，統(tǒng)計分析運用SPSS13.0軟件。采用單因素方差分析及q檢驗進行組間的兩兩比較。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學意義。以P＜0.01作為差異有顯著統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1、應(yīng)用混合酶多次消化法，差速貼壁，成功地培養(yǎng)出純度較高的心肌細胞，α-平滑肌肌動蛋白免疫細胞化學鑒定為陽性。
　　2、流式細胞儀結(jié)果:與對照組相比，高滲組凋亡率無明顯變化(P＞0.05);高糖組的細胞凋亡明顯增多，有統(tǒng)計學意義(P＜0.

6、01);PD98059組及DMSO組較高糖組細胞凋亡無明顯變化(P＞0.05)，SP600125組及SB203580組較高糖組細胞凋亡均減少(p＜0.01)。
　　3、Caspase-3表達結(jié)果:與對照組相比，高滲組的caspase-3表達無明顯變化(P＞0.05)，而高糖組Caspase-3表達增多(P＜0.01);與高糖組相比,PD98059組細胞caspase-3表達無明顯變化(P＞0.05)，SP600125及SB2035

7、80組caspase-3表達均減少(P＜0.01)。
　　4、JNK表達結(jié)果:與對照組相比，高滲組p-JNK表達無明顯變化(P＞0.05)，高糖組p-JNK明顯表達增多(P＜0.01);SP600125組較高糖組p-JNK表達明顯較少(P＜0.01);
　　5、P38表達結(jié)果:與對照組相比，高滲組p-P38表達無明顯變化(P＞0.05)，高糖組p-P38表達明顯增多(P＜0.01)，SB203580組p-P38較高糖組表達明