紅樹耐鹽的比較基因組學研究及擬南芥AtJMJ24功能分析.pdf

1、生物主要通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控來應對外界環(huán)境刺激與內(nèi)在發(fā)育節(jié)律,植物自萌發(fā)以后便固駐一地,一生要經(jīng)受眾多的生物與非生物脅迫,同時基因組中大量的轉(zhuǎn)座子和重復序列等所謂的垃圾DNA對機體也是一種潛在的內(nèi)在“脅迫”,這些不利因素要求植物在基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面具備一套精確有效的調(diào)節(jié)機制。本論文第一部分選取紅樹為對象,研究了植物在高鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點,第二部分采用擬南芥為模式,研究了表觀遺傳在轉(zhuǎn)錄沉默中的調(diào)控機制。
　　 近年來發(fā)展起來的新一代測

2、序技術(shù)帶來的測序革命為我們在非模式物種中開展基因組學研究提供了基礎。紅樹林是生長于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落,其對于鹽生環(huán)境具有高度的適應性,是一類極好的進化與生態(tài)功能基因組學的研究模型。我們首先使用Solexa測序技術(shù)測定了紅樹植物角果木(Ceriops tagal)和其近緣的非紅樹植物旁杞木(Carallia longipes)在各自正常生境條件下的轉(zhuǎn)錄組,通過比較我們發(fā)現(xiàn)紅樹轉(zhuǎn)錄組中環(huán)境脅迫響應成分,能量代謝成分,對光反

3、應成分等顯著富集,而與生長發(fā)育過程相關(guān)的組分則缺乏。通過這個研究,我們在獲悉表達譜的同時得到了角果木和旁杞木大量EST序列,為這兩個物種及近緣物種的群體遺傳學,物種形成,以及功能基因組學研究的開展奠定了基礎,同時也為Solexa測序技術(shù)在高等非模式植物中的應用提供了一個借鑒。
　　 我們使用實時定量PCR驗證了一批受鹽誘導的紅樹功能基因,結(jié)合RACE及染色體步移技術(shù),獲得了P5CS,NHX,CDPK,CIPK,WRKY等一批基因

4、的全長或近全長cDNA,及部分基因的5'調(diào)控區(qū)序列。與對鹽敏感的擬南芥同源基因比較顯示,紅樹抗鹽基因在蛋白水平并沒有表現(xiàn)出更高效力的抗鹽能力,但是在表達調(diào)控上顯示了“顯著”的差異。紅樹耐鹽基因表現(xiàn)出更強的組織特異性,擬南芥NHX1基因在植物各個器官都比較均衡的表達,紅樹植物桐花樹NHX1只是在葉中強烈表達,這可能與桐花樹的泌鹽機制密切相關(guān),這種特化可能是紅樹適應鹽生環(huán)境的重要方面。
　　 紅樹鹽誘導基因不僅是一種重要的遺傳資源,

5、而且為在分子水平檢驗自然選擇提供了一個極好的材料,鹽耐受基因的群體遺傳和進化分析將為我們了解各種進化動力在紅樹鹽適應形成過程的作用提供重要信息。首先,為衡量基因組水平桐花樹的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu),我們采集世界范圍的13個桐花樹種群共計202個個體用AFLP分子標記進行了基因組掃描,結(jié)果顯示桐花樹具有較高的遺傳多樣性(P=92％,HE=0.294,HS=0.331),同時種群間存在巨大的遺傳分化(GST=0.698)。在此基礎上,我們選取

6、了中國、泰國、斯里蘭卡和澳大利亞的八個代表性種群,對四個受鹽激顯著上調(diào)的表達基因:AcP5CS、AcNHD、AcNHX2和AceIF3B進行了群體遺傳和分子進化分析。四個基因表現(xiàn)了不同的進化模式,雖然地理隔離和群體的進化歷史可以部分解釋這些現(xiàn)象,各地的生態(tài)環(huán)境因素可能也發(fā)揮了極重要的作用。地理隔離和群體歷史對于整個基因組的影響是相似的,我們檢測到的不一致提示自然選擇等因素在其中起了一定的作用,這需要選取更多的基因位點進一步研究。

7、　　 siRNA介導的基因沉默及異染色質(zhì)形成在保持基因組完整性中發(fā)揮著重要的作用,此過程中雙鏈RNA的形成是關(guān)鍵,除少部分位點具有反向重復結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄本有重疊的基因?qū)梢宰匀恍纬呻p鏈外,擬南芥中主要通過RDR2(RNAdependent RNA polymerase2)來完成雙鏈RNA的合成。
　　 用RDR2作誘餌經(jīng)酵母雙雜交篩選我們得到一個相互作用蛋白AtJMJ24,初步分析AtJMJ24具有RING和JmjC兩個功能域。通

8、過詳實的生化實驗我們證實AtJMJ24與RDR2在體內(nèi)體外都有相互作用,而且在體內(nèi)體外都可以泛素化RDR2,該泛素化極可能是單泛素化,而且在體內(nèi)JMJ24泛素化RDR2可以穩(wěn)定RDR2,我們進一步用蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)確定了一個泛素化位點。同時我們還證實AtJMJ24具有H3K9me2去甲基化活性,對于沉默位點基礎量轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生是必需的,通過對jmj24與rdr2雙突變體的分析,我們確定兩者作用在同一信號通路中,JMJ24作用于RDR2的上游