肺炎克雷伯菌質(zhì)粒的比較基因組學(xué)分析.pdf

1、目的：
　　1.研究肺炎克雷伯菌質(zhì)粒的分子進(jìn)化及存在的基因水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象;
　　2.分析肺炎克雷伯菌質(zhì)粒中攜帶的mmuM基因并探索其散播方式;
　　3.初步研究肺炎克雷伯菌多質(zhì)粒共存的質(zhì)粒相容性。
　　方法：
　　1.獲取肺炎克雷伯菌pKF3-70、pKF3-94和pKF3-140質(zhì)粒的完整基因組序列;對(duì)三個(gè)質(zhì)粒分別按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)重新進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)及功能注釋?zhuān)⒒敬_定pKF3-94質(zhì)粒的基因組結(jié)構(gòu)。
　　

2、2.收集數(shù)據(jù)庫(kù)中的全部質(zhì)?；蚪M序列，鑒定質(zhì)粒中的同源基因并構(gòu)建質(zhì)粒的基因內(nèi)容樹(shù)，進(jìn)行質(zhì)粒的進(jìn)化分析。
　　3.利用plasmidRST系統(tǒng)，對(duì)pKF3-70、pKF3-94和pKF3-140質(zhì)粒的復(fù)制子進(jìn)行鑒定，初步研究質(zhì)粒的相容性現(xiàn)象。
　　4.檢索、篩選并獲取數(shù)據(jù)庫(kù)中全部mmuM基因的核苷酸序列，通過(guò)聚類(lèi)分析和進(jìn)化分析研究mmuM基因的變異情況。
　　5.通過(guò)與本室的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)集進(jìn)行mapping，進(jìn)一步分析

3、mmuM因在九種臨床致病菌中的分布情況及序列保守性，并通過(guò)PCR實(shí)驗(yàn)及測(cè)序手段進(jìn)行驗(yàn)證。
　　6.利用BLAST、Mauve等工具，對(duì)pKF3-94和pKF3-140質(zhì)粒與相關(guān)質(zhì)粒和染色體基因組進(jìn)行比較基因組分析。
　　結(jié)果：
　　1.pKF3-94質(zhì)?；蚪M結(jié)構(gòu)中的分區(qū)較為明顯:骨架（保守）區(qū)域和可變區(qū)域，其中保守區(qū)域包括了結(jié)合轉(zhuǎn)移區(qū)域和轉(zhuǎn)移引導(dǎo)區(qū)域;可變區(qū)域主要包括可移動(dòng)DNA元件、耐藥基因和復(fù)制子等功能區(qū)域。

4、r>　　2.質(zhì)粒進(jìn)化分析結(jié)果顯示，pKF3-94質(zhì)粒與pK1HV及pC15-k質(zhì)粒的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系更為相近，而與同菌株中的pKF3-70和pKF3-140質(zhì)粒相距較遠(yuǎn)。
　　3.pKF3-94與pC15-k、pK1HV質(zhì)粒除具有相同的骨架區(qū)域外，還與pC15-k質(zhì)粒共有一段長(zhǎng)15 kb的同源區(qū)域，該區(qū)域包含有兩個(gè)耐藥基因和一個(gè)復(fù)制子;而pK1HV質(zhì)粒含有一段獨(dú)特的49 kb區(qū)域，其富含多個(gè)可移動(dòng)元件和耐藥基因。
　　4.pKF

5、3-94質(zhì)粒是一個(gè)含有兩個(gè)不同的復(fù)制子類(lèi)型的多復(fù)制子質(zhì)粒，它們與pKF3-70和pKF3-140中的復(fù)制子具有較大的差異。
　　5.mmuM基因廣泛分布于各種細(xì)菌，且相互間差異較大;不同菌屬中的mmuM基因的保守性不同;進(jìn)化分析顯示，部分來(lái)自不同菌屬中的mmuM基因間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系比來(lái)自相同菌屬的更加接近。
　　6.與高通量測(cè)序數(shù)據(jù)集進(jìn)行mapping的結(jié)果顯示mmuM基因在七種臨床致病菌中都有存在;PCR實(shí)驗(yàn)及測(cè)序也進(jìn)一步

6、證實(shí)了mapping的結(jié)果。
　　7.pKF3-140質(zhì)粒與pIP1206質(zhì)粒共有一段長(zhǎng)21kb的同源區(qū)域，該區(qū)域中的4.9 kb片段與大腸桿菌基因組中的相應(yīng)區(qū)域較為一致，該片段包含一個(gè)由mmuM基因及轉(zhuǎn)座酶和插入序列組成的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論：
　　1.pK1HV和pC15-k質(zhì)粒的骨架區(qū)域可能都起源于一個(gè)pKF3-94樣的質(zhì)粒，而可變區(qū)域通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移來(lái)自其他不同的基因組中。
　　2.mmuM基因在不同種