MicroRNA-320a對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移侵襲的抑制作用及機(jī)制研究.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤簡(jiǎn)稱膠質(zhì)瘤，是神經(jīng)外科常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，同時(shí)也是治療難度最大的疾病之一。膠質(zhì)瘤具有惡性程度高、侵略性極強(qiáng)以及易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，而其本質(zhì)上是一種多基因異常的疾病，通過(guò)過(guò)表達(dá)原癌基因，伴隨抑癌基因的突變、缺失，使得腫瘤細(xì)胞逃避了細(xì)胞的正常生存機(jī)制。直至目前為止，臨床上采用手術(shù)、物理放射性治療以及聯(lián)合藥物化療等方法治療惡性膠質(zhì)瘤，盡管上述治療方法都有了很大的進(jìn)步，但患者的預(yù)后仍然不理想。隨著對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)研究不斷推進(jìn)，大量研究已

2、揭示了神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)機(jī)制以及膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的存在，并對(duì)同一病人的腫瘤或不同患者的相同類型腫瘤進(jìn)行了分子異質(zhì)性的描述。因此，在腫瘤細(xì)胞分子水平，針對(duì)其分子病理機(jī)制進(jìn)行研究，從腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程尋找突破點(diǎn)，是開(kāi)發(fā)出更有效、更精準(zhǔn)、更快捷的腫瘤治療方案的關(guān)鍵所在。
　　miRNAs是非編碼RNA家族中的一種，具有18-25個(gè)核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行基因調(diào)控。研究已確認(rèn)miRNAs在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，調(diào)控著許多與腫瘤發(fā)

3、病相關(guān)的信號(hào)通路，并在惡性膠質(zhì)瘤的進(jìn)展、細(xì)胞侵襲、腫瘤生長(zhǎng)和治療反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。MicroRNA-320a（miR-320a）位于染色體8p21.3，在肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中均異常低表達(dá)，并且研究已表明其具有多種細(xì)胞生物作用，如調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及遷移侵襲等。miR-320a在腫瘤中具有多個(gè)靶點(diǎn)基因，也相繼得到了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，而在膠質(zhì)瘤中的作用和功能仍需要進(jìn)一步的探索和發(fā)現(xiàn)。
　　水通道蛋白4（AQP-4）是水通道蛋白家族

4、中的一員，具有在腦組織中特別富集的特點(diǎn)，并在不同的結(jié)構(gòu)區(qū)域發(fā)揮不同的功能。最初AQP-4被定義為一種純粹的水分子運(yùn)送蛋白，在腦組織中參與了組織水腫、細(xì)胞水的調(diào)節(jié)及腦脊液的形成。然而，AQP-4的細(xì)胞生物學(xué)功能不僅如此，它還能富集在膠質(zhì)細(xì)胞終足上，參與細(xì)胞膜的解離與重組，在細(xì)胞延伸與運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。值得注意的是，基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）同樣具有促進(jìn)細(xì)胞侵襲和遷移的功能。因此，我們提出假設(shè)：miR-320a是否能調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵

5、襲和遷移，以及AQP-4、MMP-9在此過(guò)程中發(fā)揮什么作用？
　　目的:
　　本研究以人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤U87、U251細(xì)胞株為研究對(duì)象，觀察miR-320a對(duì)細(xì)胞侵襲遷移的影響。以生物信息學(xué)分析為基礎(chǔ)，探討miR-320a的作用機(jī)制，以及AQP-4、MMP-9在此過(guò)程中發(fā)揮的作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析，為臨床治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供更多的理論依據(jù)和藥物靶點(diǎn)參考。
　　方法:
　　生物信息學(xué)分析CGGA(Chinese Glio

6、ma Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)，分析miR-320a在高級(jí)別和低級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤的表達(dá)差異以及高低表達(dá)miR-320a的總生存率的差異；用miRBase、Targetscan和microRNA.org進(jìn)行miR-320a靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，分析出miR-320a在AQP-4 mRNA3’-UTR結(jié)合區(qū)域，化學(xué)合成序列、構(gòu)建質(zhì)粒進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證；腦膠質(zhì)瘤組織切片免疫組織化學(xué)染色鑒定AQP-4的表達(dá)水平；體外培養(yǎng)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U8

7、7、U251，分別進(jìn)行 miR-320a及 miRNA negative control（miR-NC）mimics轉(zhuǎn)染，48小時(shí)后qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，Transwell實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移侵襲能力，qPCR和Western Blot檢測(cè)AQP-4及MMP-9 mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況、免疫熒光檢測(cè)AQP-4蛋白表達(dá)情況；對(duì)AQP-4基因進(jìn)行干擾，qPCR和Western Blot檢測(cè)AQP-4基因干擾后mRNA和蛋白表達(dá)水平，Tra

8、nswell實(shí)驗(yàn)分析基因干擾后侵襲和遷移能力。
　　結(jié)果:
　　1. CGGA數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示：miR-320a在WHOⅣ和Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平明顯低于WHOⅡ級(jí)膠質(zhì)瘤，并且高表達(dá)miR-320a組的總生存率也明顯高于低表達(dá)miR-320a組。
　　2.預(yù)測(cè)靶點(diǎn)分析：AQP-4 mRNA3’-UTR2000 bp內(nèi)有3個(gè)miR-320a結(jié)合靶點(diǎn)。經(jīng)過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因的分析驗(yàn)證，其中848-870 bp區(qū)域?yàn)閙iR-

9、320a的有效結(jié)合區(qū)域。
　　3.臨床標(biāo)本組織切片分析：對(duì)正常腦組織及WHOⅡ和WHOⅣ膠質(zhì)瘤組織進(jìn)行HE和IHC染色分析。HE染色結(jié)果顯示：與正常腦組織相比較，Ⅳ級(jí)腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞異型性明顯，有瘤巨細(xì)胞形成、核大小不一、染色質(zhì)豐富，有核分裂象。IHC結(jié)果顯示，AQP-4在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)和極性分布，且與腫瘤W HO分級(jí)呈正比。
　　4. miR-320a過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：U87和U251細(xì)胞株分別轉(zhuǎn)染miR-320a和m

10、iR-NC mimics，qPCR結(jié)果顯示：與miR-NC和空白對(duì)照組相比miR-320a mimic組中miR-320a的表達(dá)量顯著增高，而miR-NC組與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異。Transwell功能實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)miR-320a后能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　5. qPCR和WB結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)miR-320a能顯著降低AQP-4 mRNA和蛋白水平的表達(dá)，MMP-9的表達(dá)則無(wú)明顯變化。
　　6.

11、qPCR和 WB結(jié)果顯示：AQP-4 siRNA轉(zhuǎn)染后能顯著降低AQP-4 mRNA和蛋白水平的表達(dá)，Transwell功能實(shí)驗(yàn)顯示干擾AQP-4的表達(dá)能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　7.免疫熒光結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)miR-320a和干擾AQP-4后能明顯降低腫瘤細(xì)胞AQP-4蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.miR-320a在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中異常低表達(dá)，并且與臨床預(yù)后相關(guān)。
　　2.抑制AQP-4的表達(dá)能有效