PTPH1對神經膠質瘤細胞增殖和侵襲的影響及機制研究.pdf

1、神經膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤。證據(jù)表明，癌癥易于復發(fā)、難以根治的重要原因是腫瘤細胞不可控制的生長和高侵襲性。因此闡明神經膠質瘤過度增殖和高侵襲轉移特性的分子機制，將有助于開發(fā)治療膠質瘤的新靶點，從而改善膠質瘤患者的預后。
　　蛋白酪氨酸磷酸酶H1(PTPH1)，又被稱為酪氨酸-蛋白質磷酸酶非受體類型3(PTPN3)，是PTP家族的一員，由PTPN3基因編碼，定位于第9號染色體，轉錄mRNA產物全長6599bp，編碼8

2、68個氨基酸，含有一個C末端的PTP結構域、一個PDZ結構域和一個N末端結構域同源的細胞骨架相關蛋白超家族頻帶4.1結構。研究表明PTPH1在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。例如，在膽管細胞癌中，外顯子測序發(fā)現(xiàn)PTPH1基因存在突變，而且過表達PTPH1能夠促進膽管細胞癌細胞增殖、克隆形成能力和侵襲遷移能力。在食管癌和乳腺癌臨床樣本中，PTPH1呈現(xiàn)高表達，而且其表達與乳腺癌患者腫瘤轉移和預后相關。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PTPH1通過作用

3、于多種底物發(fā)揮其磷酸酶活性，從而在細胞行為中起到一定的作用，目前檢測到的底物包括腫瘤壞死因子α轉化酶，T細胞受體ら亞基，維生素D受體，雌激素受體等等。然而，PTPH1在神經膠質瘤組織中的表達和功能目前尚未報道，本課題旨在檢測膠質瘤患者臨床樣本中PTPH1的表達水平，并分析PTPH1在膠質瘤細胞增殖和侵襲遷移中的作用及其分子機制，從而為膠質瘤治療提供新的藥物作用靶點。
　　目的：
　　1.檢測神經膠質瘤臨床組織樣本PTPH1的

4、表達情況。
　　2.驗證基因敲低PTPH1表達的效率。
　　3.研究PTPH1對膠質瘤細胞增殖的影響。
　　4.分析PTPH1對膠質瘤細胞周期分布的影響。
　　5.探討PTPH1對膠質瘤細胞周期相關蛋白表達的影響。
　　6.研究PTPH1對膠質瘤細胞成瘤能力的影響。
　　7.分析PTPH1對膠質瘤細胞侵襲及遷移能力的影響。
　　8.探究PTPH1對膠質瘤細胞基質金屬蛋白酶表達的影響。
　　

5、9.研究PTPH1影響膠質瘤細胞生長和遷移的分子機制。
　　方法：
　　1.神經膠質瘤組織標本中PTPH1表達
　　本研究前期收集了15例神經膠質瘤患者配對的癌旁組織和神經膠質瘤組織，采用real time PCR技術檢測PTPH1基因的表達情況。后期我們采集了2013-2015年在山東大學齊魯醫(yī)院進行膠質瘤切除術的患者腫瘤組織樣品，并按WHO分級分別監(jiān)測PTPH1表達情況，監(jiān)測13例膠質瘤Ⅱ級、13例膠質瘤Ⅲ級、13

6、例膠質瘤Ⅳ級、以及4例正常腦組織切片中的PTPH1的蛋白表達水平進行了免疫組化檢測。
　　2.PTPH1基因干擾效率
　　設計并合成PTPH1特異性shRNA和scramble shRNA，構建慢病毒載體，并包被病毒質粒，病毒質粒用綠色熒光(GFP)標記，用以感染神經膠質瘤U87或U251細胞，用熒光顯微鏡觀察感染情況，然后采用real time PCR檢測空白對照組、scrambled shRNA組和PTPH1基因特異性s

7、hRNA組U87和U251細胞中PTPHlmRNA水平表達情況。最后再用Western blot測定空白對照組、scrambled shRNA組和PTPH1基因特異性shRNA組U87和U251細胞中PTPH1的蛋白表達水平。
　　3.PTPH1對膠質瘤細胞增殖的影響
　　將生長狀態(tài)良好的神經膠質瘤U87或U251，按照1×106/孔的密度接種到96孔板中，每組設計3個復孔，采用CCK-8方法檢測細胞活力;取生長狀態(tài)良好的U

8、87或者U251細胞接種到6孔板，每組設計3個復孔，調整細胞密度為100個/孔，用結晶紫染色液對形成的細胞克隆染色，并在光鏡下觀察細胞克隆數(shù)目。
　　4.PTPH1對膠質瘤細胞周期分布的影響
　　取對數(shù)生長期的U87或U251細胞，用預冷70％乙醇處理細胞，加PI試劑，采用流式細胞儀檢測不同細胞周期細胞比例。
　　5.PTPH1對膠質瘤細胞周期相關蛋白表達的影響
　　取對數(shù)生長期的U87或U251細胞，收集并定量

9、蛋白，采用western blot檢測CDK2和cyclinB1蛋白表達強度。
　　結果：
　　1.神經膠質瘤組織標本中PTPH1表達
　　我們首先檢測了神經膠質瘤臨床標本中PTPH1的表達情況。前期我們收集了15例神經膠質瘤患者配對的癌旁組織和神經膠質瘤組織，并采用熒光定量PCR技術檢測PTPH1基因的轉錄水平。結果顯示，PTPH1在15例神經膠質瘤患者癌旁組織和神經膠質瘤組織中均有所表達;和癌旁組織相比，PTPH1

10、在膠質瘤組織中表達水平顯著上升（約3.5倍），差異有統(tǒng)計學意義，(P＜0.01)。后期我們按照WHO分級再次分別對13例膠質瘤Ⅱ級、13例膠質瘤Ⅲ級、13例膠質瘤Ⅳ級、以及4例正常腦組織切片中的PTPH1的蛋白表達水平進行了免疫組化檢測。結果顯示，在各個級別膠質瘤中都極易檢測到PTPH1的表達，且隨著級別升高，PTPH1表達顯著升高，而在正常腦組織中，PTPH1表達則顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義，(P＜0.01)。
　　2.PTPH

11、1基因干擾效率
　　我們通過包被慢病毒的方法將PTPH1基因特異性shRNA(Lv-shPTPH1)轉染進入U87和U251神經膠質瘤細胞系中，同時轉染scrambled shRNA作為實驗對照組(Lv-shCon)，同時還設置了空白對照組。結果顯示，95％以上的U87和U251膠質瘤細胞均成功感染攜帶Lv-shCon和Lv-shPTPH1的病毒質粒。和空白對照組相比，轉染scrambled shRNA的U87和U251膠質瘤細胞

12、中PTPH1的mRNA表達水平幾乎沒有變化;和scrambled shRNA對照組相比，轉染Lv-shPTPH1的U87和U251細胞中PTPH1的mRNA表達水平顯著下降(P＜0.01)。此外，轉染Lv-shPTPH1的U87和U251細胞中PTPH1蛋白表達水平明顯降低。
　　3.PTPH1對膠質瘤細胞周期和細胞增殖的影響
　　3.1和空白對照組相比，轉染scrambled shRNA的U87和U251膠質瘤細胞周期沒有

13、顯著差別。然而，干擾PTPH1基因的U87膠質瘤細胞中G2/M期細胞數(shù)量占所有細胞數(shù)量的比例減少18％，S期細胞數(shù)量占所有細胞數(shù)量的比例增加9％。此外，干擾PTPH1基因表達同樣引起U251細胞周期S期阻滯。
　　3.2和空白對照組相比，轉染scrambled shRNA的U87和U251膠質瘤細胞中CDK2和cyclinB1蛋白表達沒有顯著差別;PTPH1基因敲低后導致U87和U251膠質瘤細胞中CDK2和cyclinB1蛋白表

14、達明顯下調。
　　3.3在細胞培養(yǎng)的前兩天，空白對照組、scrambled shRNA組和Lv-shPTPH1組細胞活力沒有明顯差別;當細胞培養(yǎng)到第3天，干擾PTPH1導致U87和U251神經膠質瘤細胞活力分別下降46％和18％;并且從第3天開始，U87和U251神經膠質瘤細胞活力持續(xù)下降（P＜0.01或者P＜0.05）;當培養(yǎng)到第5天，PTPH1干擾后的U87和U251細胞活力分別是對照組細胞活力的45％和76％?？寺⌒纬蓪嶒烇@

15、示，PTPH1干擾導致U87和U251細胞數(shù)量分別下降73.5％和80.7％。
　　3.4當小鼠飼養(yǎng)至第16天時，兩組小鼠在腫瘤大小方面沒有明顯區(qū)別(P＞0.05)。當飼養(yǎng)至第20天時，注射干擾PTPH1表達的U87細胞的小鼠的腫瘤體積縮小14.3％，并且腫瘤縮小的趨勢隨著飼養(yǎng)時間的增加愈加明顯。此外，干擾PTPH1表達導致腫瘤重量明顯下降。
　　4.PTPH1對膠質瘤細胞侵襲及遷移能力的影響
　　Transwell侵

16、襲及遷移實驗表明，空白對照組和scrambled shRNA組中膠質瘤細胞的侵襲及遷移能力沒有明顯差別;和scrambled shRNA組相比，PTPH1基因敲低后U87和U251細胞侵襲及遷移能力分別下降60％和53％。Westernblot結果表明，空白對照組和scrambled shRNA組膠質瘤細胞MMP9的蛋白表達水平沒有明顯差別;然而，和對照組相比干擾PTPH1表達導致U87和U251細胞中MMP9蛋白表達水平顯著降低。

17、r>　　5.PTPH1影響膠質瘤細胞生長和遷移的分子機制
　　Western blot結果顯示，和空白對照組相比，scrambled shRNA組膠質瘤細胞MEK磷酸化水平沒有顯著變化;干擾PTPH1導致U87和U251細胞中MEK的磷酸化水平明顯降低，但MEK總蛋白表達水平保持不變。此外，我們發(fā)現(xiàn)干擾PTPH1表達導致U87和U251細胞中MAPK的磷酸化水平顯著下調，但MAPK總蛋白水平沒有明顯變化。
　　結論：