G-CSF及褪黑素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制研究.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤(Glioma)是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤的50％。膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，惡性程度高，患者預(yù)后差，是引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤相關(guān)性死亡的首要原因。近年來，膠質(zhì)瘤治療在手術(shù)方式、放療、化療、免疫治療以及基因治療等方面有了很大進(jìn)展，但是膠質(zhì)瘤仍然不能被治愈，患者中位生存期不超過1年。膠質(zhì)瘤之所以不能被治愈，主要是因其具有高增殖力和強(qiáng)遷移侵襲性。因此，控制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移侵襲是治療膠質(zhì)瘤的首要目標(biāo)。然

2、而，現(xiàn)存的治療手段受到藥物神經(jīng)毒性、血液毒性以及難以透過血腦屏障(Brainbloodbarrier，BBB)等諸多限制，對(duì)膠質(zhì)瘤的治療效果并不理想。因此，亟需開發(fā)新的有效且低毒并容易穿過血腦屏障的治療手段，并且新的治療手段需要對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移侵襲的分子機(jī)制進(jìn)行深入的研究。
　　 粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocytecolony-stimulatingfactor，G-CSF)和褪黑素是臨床常用的兩種藥物，均具有神經(jīng)

3、保護(hù)作用，且能透過血腦屏障。G-CSF具有促進(jìn)骨髓造血的作用，臨床上常用于骨髓抑制造成的粒細(xì)胞減少癥，已經(jīng)成為腫瘤治療中重要的輔助治療手段，但其對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用，尚需進(jìn)一步探討。有研究報(bào)道褪黑素具有抗腫瘤的作用，有望成為膠質(zhì)瘤的輔助治療手段。
　　 G-CSF是生長因子家族成員，通過與其特異性受體G-CSF受體(G-CSFR)結(jié)合發(fā)揮作用，主要功能是刺激骨髓產(chǎn)生粒細(xì)胞和干細(xì)胞。除了造血系統(tǒng)，G-CSF還可以作用于神經(jīng)系統(tǒng)，尤其在

4、腦缺血等疾病狀態(tài)下，G-CSFR在神經(jīng)元中表達(dá)，被G-CSF激活后能夠阻止神經(jīng)元凋亡。G-CSF也可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞(Neuralstemcells，NSCs)的增殖和分化。這些現(xiàn)象都說明G-CSF在神經(jīng)源性細(xì)胞的生長和維持方面發(fā)揮著重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF與G-CSFR與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。造血干細(xì)胞中G-CSF信號(hào)通路持續(xù)過度激活可導(dǎo)致血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生。同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)G-CSF與G-CSFR在多種腫瘤中表達(dá)，如黑

5、色素瘤、肺小細(xì)胞癌、膀胱癌、前列腺癌及腦腫瘤等，并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲。但是目前G-CSF在人腦膠質(zhì)瘤中的作用與作用機(jī)制尚不清楚。
　　 褪黑素(Melatonin)是由松果體(Pineal)、視交叉上核(Suprachiasmaticnucleus)及周圍組織合成分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有抗氧化作用，在神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茲海默病(Alzheimer'sdisease，AD)和帕金森氏病(Parkinson'sdi

6、sease，PD)及腦缺血性疾病中保護(hù)神經(jīng)元免受自由基損傷。研究發(fā)現(xiàn)褪黑素還具有抗腫瘤作用，能夠抑制包括前列腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌，黑色素瘤、卵巢癌及乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤生長。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中，褪黑素通過提高E鈣粘蛋白和β1整合素水平、調(diào)節(jié)微絲的排列及降低基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的產(chǎn)生抑制腫瘤細(xì)胞侵襲。有研究報(bào)道一定濃度的褪黑素能夠阻止膠質(zhì)瘤細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期從而抑制細(xì)胞增殖。但是，褪黑素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、

7、遷移和侵襲的影響及機(jī)制仍不明確。
　　 本課題包含兩部分，分別研究G-CSF及褪黑素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并探討其機(jī)制，以期為膠質(zhì)瘤的治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 一、G-CSF對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制研究
　　 1.G-CSF和G-CSFR在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及與膠質(zhì)瘤惡性程度的關(guān)系
　　 為了檢測G-CSF和G-CSFR在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，我們收集了29例人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本，

8、所有標(biāo)本均依據(jù)2007年世界衛(wèi)生組織(WorldHealthOrganization，WHO)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理診斷并分級(jí)。其中WHOⅠ/Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤8例，Ⅲ級(jí)間變性膠質(zhì)瘤9例，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤12例。同時(shí)我們也收集了5例顱腦外傷病人行減壓手術(shù)切除的腦組織作為正常對(duì)照。所有標(biāo)本均提取總RNA和總蛋白，并制作冰凍切片，利用RT-PCR、Westernblot及免疫組織化學(xué)方法分別從mRNA和蛋白水平檢測G-CSF和G-CSFR

9、的表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示G-CSF和G-CSFRmRNA在四種級(jí)別的膠質(zhì)瘤中均有表達(dá);Westernblot和免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示G-CSFR蛋白在四種級(jí)別膠質(zhì)瘤中也均能檢測到。其中G-CSF和G-CSFR在7例Ⅰ/Ⅱ級(jí)，8例Ⅲ級(jí)和12例Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中共表達(dá)。G-CSF和G-CSFR在四種級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平差異不具有顯著性。在作為正常對(duì)照的5例腦組織中均未檢測到G-CSF和G-CSFR的表達(dá)。
　　 此外，我們還檢測了G-

10、CSF和G-CSFR在原代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞G0518、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G以及原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示G-CSF和G-CSFR在原代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞G0518和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系T98G中均有表達(dá)，而在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中則未檢測到表達(dá)。以上結(jié)果說明G-CSF與G-CSFR在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)。
　　 2.G-CSF對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響
　　 為了研究G-CSF對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，

11、我們從惡性膠質(zhì)瘤病人腫瘤組織中分離并培養(yǎng)細(xì)胞，構(gòu)建原代培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞G0518，并采用膠質(zhì)瘤細(xì)胞株T98G作為體外模型。利用外源性G-CSF刺激膠質(zhì)瘤細(xì)胞，通過MTT法檢測G-CSF對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，G-CSF明顯促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力，作用呈劑量依賴性，濃度為100ng/ml時(shí)促進(jìn)作用最強(qiáng)。通過BrdU摻入實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)方法，研究G-CSF對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖

12、、遷移及侵襲的影響。結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，外源性G-CSF明顯促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。
　　 3.G-CSF促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的機(jī)制
　　 為了研究G-CSF促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的機(jī)制，我們首先利用G-CSFR抗體中和G-CSFR，阻斷G-CSF信號(hào)通路，結(jié)果顯示相對(duì)于對(duì)照組，G-CSFR抗體明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這說明G-CSF通過與G-CSFR結(jié)合發(fā)揮作用

13、。
　　 有研究報(bào)道G-CSF與G-CSFR的結(jié)合激活G-CSFR將胞外信號(hào)傳到10胞內(nèi)，后者進(jìn)一步激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(SignalTransducerandActivatorofTranscription3，STAT3)通路將信號(hào)向細(xì)胞核內(nèi)傳導(dǎo)。因此，為了進(jìn)一步研究G-CSF促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的機(jī)制，我們利用Westernblot的方法，檢測G-CSF對(duì)STAT3的活化的影響。結(jié)果顯示，外源性G-CSF可

14、以激活胞內(nèi)STAT3，而且這種激活效應(yīng)呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性:磷酸化的STAT3(phosphorylatedSTAT3，p-STAT3)水平在G-CSF刺激5min即開始升高，15min達(dá)到高峰，1h左右回落至基礎(chǔ)水平;G-CSFR抗體預(yù)處理則可以抵消外源性G-CSF對(duì)STAT3的激活效應(yīng)。以上結(jié)果表明，G-CSF參與STAT3活化的調(diào)節(jié)。
　　 為了進(jìn)一步研究STAT3通路活化與G-CSF在膠質(zhì)瘤中作用的關(guān)系，我們利用實(shí)時(shí)定量PC

15、R檢測了外源性G-CSF和G-CSFR抗體對(duì)STAT3下游與增殖、凋亡、侵襲及血管形成相關(guān)靶分子基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示外源性G-CSF促進(jìn)STAT3下游靶分子Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2associatedXprotein，Bax)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcelllymphoma/leukimia2，Bcl-2)、血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(

16、matrixmetalloproteinase2，MMP2)及MMP9的基因表達(dá);G-CSFR抗體則抑制這些分子的表達(dá)，并引起B(yǎng)ax/Bcl-2的比值升高。這些結(jié)果提示STAT3信號(hào)通路參與G-CSF對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的調(diào)節(jié)。
　　 在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)G-CSF與G-CSFR在膠質(zhì)瘤中過度表達(dá)，不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤中表達(dá)無顯著性差異。G-CSF促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，提示G-CSF可能參與膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展。G-C

17、SFR抗體抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，提示G-CSFR可能是潛在的治療靶點(diǎn)。G-CSF激活STAT3促進(jìn)其下游與增殖、凋亡、侵襲及血管形成相關(guān)的靶分子基因的表達(dá)，提示STAT3信號(hào)通路參與介導(dǎo)G-CSF對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的調(diào)節(jié)。
　　 二、褪黑素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制研究
　　 1.褪黑素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響
　　 我們首先利用MTT法檢測不同濃度褪黑素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活

18、力的影響。結(jié)果顯示，無論1nM生理濃度還是1mM藥理濃度的褪黑素處理24h均不影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力。臺(tái)盼藍(lán)拒染法結(jié)果顯示，生理濃度和藥理濃度的褪黑素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活無明顯影響。然后，我們利用劃痕試驗(yàn)和Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測褪黑素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響，結(jié)果顯示，1mM褪黑素明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，1nM褪黑素則無此作用。以上結(jié)果說明褪黑素抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲，不影響膠質(zhì)瘤的增殖能力。
　　 2.褪黑素

19、抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的機(jī)制研究
　　 為研究褪黑素抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的機(jī)制，我們首先利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測了褪黑素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP2和MMP9表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，1mM褪黑素明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP2和MMP9的表達(dá)。上述結(jié)果提示，褪黑素可能通過抑制MMPs表達(dá)來抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲。
　　 褪黑素是自由基清除劑，通過對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測，我們發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)條件下，膠質(zhì)瘤細(xì)胞能產(chǎn)生一定量的RO

20、S，褪黑素處理后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低。上述結(jié)果表明褪黑素處理改變了膠質(zhì)瘤細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，提示其可能對(duì)氧化應(yīng)激通路產(chǎn)生影響。NF-κB是氧化應(yīng)激通路重要的節(jié)點(diǎn)分子，受ROS調(diào)控，并能調(diào)節(jié)MMPs表達(dá)，因此，我們檢測了NF-κB活化情況。Westernblot結(jié)果顯示NF-κB在正常培養(yǎng)條件下的膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)持續(xù)活化，褪黑素可降低其活化水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB活化抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(Pyrrolidinedithio

21、carbamate，PDTC)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲及MMP2和MMP9表達(dá)，且不影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力，與褪黑素作用相似。以上結(jié)果提示氧化應(yīng)激通路參與褪黑素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)節(jié)。
　　 在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)1mM褪黑素抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲及MMP2和MMP9表達(dá)，但不影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。1mM褪黑素降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平并抑制NF-κB激活。NF-κB活化抑制劑在膠質(zhì)瘤增殖、遷移和侵襲中的作用與褪黑素相