IRAK1激酶在結(jié)腸癌中作為西妥昔單抗協(xié)同作用靶標(biāo)機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　EGFR靶向治療的出現(xiàn)給結(jié)直腸癌患者帶來了新的希望，但是由于原發(fā)或繼發(fā)性耐藥的存在，導(dǎo)致其作用效果往往不能持久。目前已知結(jié)腸癌患者對西妥昔單抗耐藥的主要原因是KRAS基因的突變，然而對于KRAS野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞的耐藥機(jī)制尚未完全闡明。前期研究中我們通過對西妥昔處理的體外培養(yǎng)結(jié)腸癌組織進(jìn)行基因芯片分析和細(xì)胞高內(nèi)涵篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IRAK1激酶具有協(xié)同克服結(jié)腸癌對西妥昔單抗耐藥的作用?；仡櫸墨I(xiàn)發(fā)現(xiàn)，IRAK1激酶可激活下游N

2、F-κB、PI3K/Akt等與結(jié)直腸癌細(xì)胞對西妥昔單抗耐藥密切相關(guān)的信號通路。因此我們猜想西妥昔單抗激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)IRAK1介導(dǎo)的信號通路導(dǎo)致對耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，靶向抑制 IRAK1可協(xié)同西妥昔單抗的抗腫瘤作用。本研究將在前期工作基礎(chǔ)通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這一假說。本項(xiàng)目對于揭示KRAS野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞耐EGFR靶向治療的新機(jī)制，對于開發(fā)新的靶向藥物和治療方案具有重要意義。
　　目的：
　　研究IRAK1與結(jié)腸癌對西妥昔單抗耐

3、藥之間的關(guān)系；探索IRAK抑制劑提高西妥昔單抗對腫瘤抑制作用的具體機(jī)制。
　　方法：
　　1.通過qRT-PCR及Western blot技術(shù)檢測IRAK1及其磷酸化分子p-IRAK1在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞及三種RAS野生型結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，通過WST-1法及平板克隆法檢測該分子表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞增殖之間的關(guān)系，利用AnexxinV法檢測使用IRAK抑制劑后對細(xì)胞凋亡的影響；
　　2.在高表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞系中單獨(dú)或聯(lián)

4、合使用IRAK抑制劑和西妥昔單抗，利用WST-1法檢測各組細(xì)胞增殖水平，接著利用Western blot技術(shù)觀察IRAK1及其下游可能相關(guān)的分子的變化從而篩選出下游靶分子；
　　3.利用組織芯片及普通組織切片檢測 IRAK1在結(jié)腸癌患者的癌組織及癌旁組織中的表達(dá)是否有差異，并分析該分子的表達(dá)與患者的預(yù)后之間是否有相關(guān)性；
　　4.通過裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IRAK抑制劑與西妥昔單抗對腫瘤細(xì)胞活性及細(xì)胞內(nèi)部分子表達(dá)水平的影響。

5、>　　結(jié)果：
　　1.IRAK1分子在結(jié)腸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)且與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡相關(guān)。我們分別從RNA和蛋白水平檢測了正常結(jié)腸上皮細(xì)胞和三種RAS野生型結(jié)腸癌細(xì)胞中IRAK1及p-IRAK1分子的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)它們在正常上皮細(xì)胞中表達(dá)量很低，在三種結(jié)腸癌細(xì)胞中HT-29和RKO細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于DiFi細(xì)胞，西妥昔單抗藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HT-29及RKO對其敏感性明顯低于DiFi細(xì)胞，提示IRAK分子與結(jié)腸癌細(xì)胞對西妥昔單抗的敏

6、感性相關(guān)。我們對HT-29和RKO細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行西妥昔單抗和IRAK抑制劑處理后發(fā)現(xiàn)西妥昔單抗對腫瘤細(xì)胞的抑制作用明顯提高。對這兩種細(xì)胞系進(jìn)行抑制劑處理后可以發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的凋亡水平明顯升高，細(xì)胞周期的靜止期明顯延長。
　　2.TRAF6是IRAK1的直接底物分子，IRAK1抑制劑可以通過影響NF-κB及ERK活化過程而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在對耐藥細(xì)胞系HT-29、RKO進(jìn)行西妥昔單抗處理后發(fā)現(xiàn)IRAK1及p-IRAK1明顯升高的同時(shí)

7、伴隨著p-ERK及p-p65升高，對它們進(jìn)行IRAK抑制劑或者siIRAK1處理后發(fā)現(xiàn)p-ERK及p-p65明顯降低，說明這兩個(gè)分子可能是IRAK的下游作用分子。為了從基因水平研究IRAK1分子改變后對細(xì)胞內(nèi)信號通路分子的影響，我們分別設(shè)計(jì)了該分子的上下調(diào)慢病毒，在HT-29細(xì)胞系轉(zhuǎn)染IRAK1的下調(diào)病毒后我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的增殖水平明顯降低，且下游分子改變與IRAK1抑制劑及siIRAK1處理后的結(jié)果一致。在DiFi細(xì)胞系轉(zhuǎn)染上調(diào)病毒s

8、hIRAK1后，細(xì)胞的增殖水平略有升高，且伴隨p-ERK及p-p65升高。在對耐藥細(xì)胞系進(jìn)行西妥昔單抗處理后發(fā)現(xiàn)p-EGFR降低的同時(shí)TLR4被明顯激活，進(jìn)而導(dǎo)致下游的IRAK1表達(dá)升高，從而抑制了其抗腫瘤的作用。
　　3.IRAK1分子表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者的預(yù)后相關(guān)，在癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。我們從上海芯超公司購買了帶5年預(yù)后及90例患者信息的結(jié)腸癌組織芯片，免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) IRAK1分子在癌組織中的表達(dá)水平明顯高

9、于癌旁組織，且與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。
　　4.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示IRAK抑制劑可以明顯提高西妥昔單抗的腫瘤抑制作用。裸鼠成瘤后待腫瘤組織長到一定大小后隨機(jī)分為4組，分別進(jìn)行DMSO、IRAK抑制劑、西妥昔單抗、IRAK抑制劑聯(lián)合西妥昔單抗。2周左右之后取腫瘤組織測量大小發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用IRAK抑制劑及西妥昔單抗可以明顯抑制腫瘤的生長。提取腫瘤組織的蛋白及RNA后進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)相關(guān)分子改變與體外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致。且我們發(fā)現(xiàn)p-IRAK1分子在

10、結(jié)腸癌細(xì)胞中的定位與其總分子不同，IRAK1主要位于細(xì)胞漿中，而磷酸化后則主要位于細(xì)胞核之中。
　　結(jié)論：
　　1.西妥昔單抗可誘導(dǎo)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞系中IRAK1分子的升高繼而出現(xiàn)耐藥。
　　2.IRAK1的表達(dá)水平與結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力呈正相關(guān)，與細(xì)胞凋亡水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
　　3.TRAF6是IRAK1的直接底物，IRAK抑制劑通過抑制下游ERK及NF-κB的活化而發(fā)揮抗腫瘤作用。
　　4.在結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞