Id1在結(jié)腸癌增殖與血管生成中的作用及可能機(jī)制研究.pdf

1、目的:探討分化抑制因子-1(Id1)在結(jié)腸癌增殖與血管生成中的作用及可能機(jī)制。
　　方法:(1)分別在體外1％O2缺氧培養(yǎng)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞0h、6h、12h、24h及36h后，利用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)及Western blot方法檢測(cè)各時(shí)點(diǎn)Id1的mRNA和蛋白表達(dá)情況。(2)建立Id1過(guò)表達(dá)和Id1抑表達(dá)兩種結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞系，分別在常氧和缺氧條件下培養(yǎng)，采用real-time PCR和We

2、stern blot方法檢測(cè)HT-29細(xì)胞HIF-1α、VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)。采集Id1過(guò)表達(dá)和Id1抑表達(dá)HT-29細(xì)胞培養(yǎng)上清液來(lái)培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，運(yùn)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HT-29細(xì)胞增殖及其培養(yǎng)上清對(duì)培養(yǎng)HUVECs體外增殖的影響。管狀形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Id1過(guò)表達(dá)HT-29細(xì)胞培養(yǎng)上清液培養(yǎng)HUVECs管狀形成的能力。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)觀察Id1過(guò)表達(dá)HT-29細(xì)胞的成瘤性、腫瘤新生微血管密度(MVD)及Id1在移植

3、腫瘤組織中的表達(dá)。(3)HT-29細(xì)胞常氧培養(yǎng)，分為4組:Id1過(guò)表達(dá)組、Id1過(guò)表達(dá)+LY294002（PI3K/Art通路抑制劑）組、空載體組及空載體+LY294002組，采用real-time PCR和Western blot方法檢測(cè)各組HIF-1α、VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)缺氧能促進(jìn)HT-29細(xì)胞Id1的mRNA和蛋白表達(dá)，缺氧12h后Id1的mRNA和蛋白表達(dá)至高峰。(2)成功建立Id1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒

4、和表達(dá)Id1-siRNA的兩種結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞系，Western blot鑒定成功。(3) real-time PCR和Western blot顯示Id1過(guò)表達(dá)能顯著上調(diào)HT-29細(xì)胞HIF-1α、VEGF的mRNA和蛋白表達(dá);Id1抑表達(dá)能顯著下調(diào)HT-29細(xì)胞HIF-1α、VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)。(4)MTT實(shí)驗(yàn)顯示Id1過(guò)表達(dá)HT-29細(xì)胞及其培養(yǎng)上清培養(yǎng)HUVECs體外增殖均明顯加快;Id1抑表達(dá)HT-29細(xì)胞及其培養(yǎng)

5、上清培養(yǎng)HUVECs體外增殖均明顯減慢。(5)管狀成形實(shí)驗(yàn)顯示Id1過(guò)表達(dá)HT-29細(xì)胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)的HUVECs管狀形成能力增強(qiáng)，管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量增加。(6)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示Id1過(guò)表達(dá)HT-29細(xì)胞成瘤性增強(qiáng)，成瘤組織的MVD增加，Id1在成瘤組織的表達(dá)也上調(diào)。(7)LY294002能顯著下調(diào)HT-29細(xì)胞HIF-1α、VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論:(1)在一定時(shí)限內(nèi)，缺氧能促進(jìn)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞Id1的mRNA和蛋