NDRG2調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞周期的機制研究及Ndrg2與P53條件性敲除小鼠模型的構(gòu)建.pdf

1、NDRG2（N-Myc downstream regulated gene2）是首先由我們課題組發(fā)現(xiàn)并報道的抑癌候選基因。其首先發(fā)現(xiàn)在星形膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞瘤中存在差異表達(dá)，近年研究已明確其在十余種腫瘤中呈低表達(dá)，并有部分研究發(fā)現(xiàn)NDRG2可參與調(diào)控增殖信號通路、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及糖代謝發(fā)揮抑癌作用。但目前的機制研究仍較為有限，對NDRG2的具體功能仍不清楚。
　　利用免疫共沉淀和質(zhì)譜技術(shù)可以鑒定到目標(biāo)蛋白的相互作用蛋白，對推測蛋

2、白功能，了解其參與的信號通路具有很好的指導(dǎo)作用。我們前期通過免疫共沉淀技術(shù)及質(zhì)譜技術(shù)鑒定到NDRG2可與多種磷酸酶存在相互作用，并且含有多種周期調(diào)控蛋白。既往已有報道NDRG2可與蛋白磷酸酶2催化亞基α（protein phosphatase2 catalytic subunit alpha，PPP2CA）存在相互作用。故我們推測，NDRG2可能通過蛋白磷酸酶參與細(xì)胞周期的調(diào)控作用。
　　細(xì)胞周期是腫瘤研究的重點研究對象，其對腫瘤

3、發(fā)生、增殖、凋亡及對化放療敏感性都有極為重要的研究意義。正常細(xì)胞中存在G1/S期和G2/M期檢查點，通過對DNA復(fù)制前和進入有絲分裂前基因組進行檢查防止DNA損傷累積。當(dāng)檢查點功能受損，就會誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生基因突變，甚至誘發(fā)癌變。在腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞周期檢查點相關(guān)分子同時參與影響細(xì)胞對化放療的敏感性。Polo樣激酶1（Polo like kinase1，PLK1）通過激活Cdc25調(diào)控G2/M期檢查點，其在多種腫瘤中存在過度活化和高表達(dá)，且利

4、用RNAi技術(shù)干擾PLK1可以抑制細(xì)胞增殖，且其在P53突變或缺失的腫瘤細(xì)胞中具有較強的抑制作用。
　　絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)磷酸化修飾的重要功能酶。真核細(xì)胞中存在500余種激酶，其中60％為絲/蘇氨酸激酶，但僅有對應(yīng)的40余種絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，故這些有限的磷酸酶可以通過不同機制對復(fù)雜底物實現(xiàn)去磷酸化。蛋白磷酸酶1（Protein phosphatase，PP1）是細(xì)胞中極為經(jīng)典的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，可參與細(xì)胞周期

5、、糖原合成與分解、肌球蛋白修飾等生理過程。PP1在G2/M期通過對PLK1第210位蘇氨酸去磷酸化抑制其功能，防止細(xì)胞逃逸檢查點快速進入有絲分裂。
　　在腫瘤研究中，細(xì)胞系和裸鼠成瘤等經(jīng)典的研究模型正面臨越來越多的挑戰(zhàn)，其真實性和可靠性也面臨質(zhì)疑。利用基因敲除小鼠進行在體功能和機制研究是目前較為穩(wěn)定和可信的研究策略。本研究室既往已建立了Ndrg2-loxp小鼠、Ndrg2結(jié)腸特異敲除小鼠、Ndrg2全身敲除小鼠，為研究其機制提供了

6、極好的模型工具。在本研究中，我們利用Ndrg2-loxp小鼠與P53-loxp小鼠進行雜交，篩選雙純合小鼠，再與含有星形膠質(zhì)細(xì)胞特異啟動子的GFAP-Cre小鼠雜交，實現(xiàn)小鼠在體星形膠質(zhì)細(xì)胞中同時敲除Ndrg2與P53。因P53在腫瘤DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期、凋亡和代謝中都有極為重要的調(diào)控作用，故該模型可幫助進一步明確NDRG2在多種腫瘤信號通路中的功能。
　　我們的研究表明，NDRG2可以通過募集PP1對PLK1去磷酸化，抑制其

7、功能，導(dǎo)致Cyclin B表達(dá)下降，引起G2/M期阻滯，抑制細(xì)胞增殖。此外，通過Cre-loxp建立的Ndrg2與P53星形膠質(zhì)細(xì)胞特異敲除小鼠可用于該作用機制的進一步模型驗證。
　　目的：
　?。?）闡明NDRG2在膠質(zhì)細(xì)胞瘤中調(diào)控細(xì)胞周期G2/M期的具體機制。
　?。?）構(gòu)建Ndrg2與P53星形膠質(zhì)細(xì)胞特異敲除小鼠。
　　方法：
　?。?）利用慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定表達(dá)技術(shù)，我們在U87MG、U251MG、

8、T98MG中建立了NDRG2過表達(dá)細(xì)胞株。
　?。?）通過免疫共沉淀和質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)了NDRG2的相互作用蛋白，并進行截短體相互作用驗證。
　?。?）利用流式細(xì)胞術(shù)和蛋白免疫印跡技術(shù)檢測 NDRG2過表達(dá)對細(xì)胞周期的影響，并研究相關(guān)分子變化。
　　（4）利用Cre-loxp系統(tǒng)建立Ndrg2與P53星形膠質(zhì)細(xì)胞特異敲除小鼠。
　　結(jié)果：
　　（1）NDRG2在膠質(zhì)細(xì)胞瘤中過表達(dá)可以引起細(xì)胞G2/M期阻滯，抑制

9、細(xì)胞增殖。
　?。?）NDRG2可以與PPP1CC有相互作用，且該作用在G2/M期增強。
　?。?）NDRG2通過募集PPP1CC增強對PLK1的去磷酸化作用，使其第210位蘇氨酸磷酸化下降，引起活性下降。
　　討論：結(jié)合既往文獻(xiàn)和本研究結(jié)果，NDRG2與多種蛋白磷酸酶有相互作用，提示其可能參與多種底物蛋白的磷酸化修飾，其具體作用方式和底物分子仍需要進一步研究。其對G2/M期檢查點的調(diào)控作用提示其可影響化放療敏感性，對